一种中华按蚊转基因体系制造技术

本发明专利技术是运用分子生物学试验方法克隆出中华按蚊卵黄蛋白原（Ｖｇ）启动子基因和中华按蚊防御素编码基因，构建表达载体质粒，显微注射转染中华按蚊卵，待蚊卵孵化后，通过在荧光显微镜下观察ＧＦＰ的表达情况和ＲＴ－ＰＣＲ试验结果，证明本发明专利技术中克隆的Ｖｇ启动子驱动Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因在转基因中华按蚊体内得到了良好的表达，构建出中华按蚊转基因体系。该转基因体系为进一步的转基因蚊研究打下了坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学领域的一种中华按蚊的转基因体系，及该转基因体系所涉及的蚊卵黄蛋白原(Vg)启动子基因和中华按蚊防御素(Defensin)基因编码序列的克隆方法，转基因体系的构建方法和该转基因体系的定性分析方法。
技术介绍
蚊属于昆虫纲、双翅目、蚊科，是一类重要的医学昆虫，迄今为止，全世界已记录蚊虫共3亚科，38属，3350多个种和亚种，其中与传染病有关的蚊种是按蚊属，库蚊属和伊蚊属，以蚊为媒介的传染病，如疟疾、丝虫病、流行性乙型脑炎、登革热等，是当今社会严重威胁人民生命健康的重要疾患；其中，疟疾和登革热属于TDR重点防治的10大主要热带病。目前，世界上仍有100多个国家为疟疾流行区，约22亿人受疟疾的威胁，每年有300～500万疟疾临床病例，病死人数为110～270万。据2003年我国专项调查统计，疟疾的实际发病人数达74万，18个省、自治区、直辖市的907个县(市、区)数亿人口受疟疾威胁。登革热的发病率近年也呈逐年递增趋势，并常有爆发性流行的报道。因此，蚊及蚊媒病的防治仍是迫切需要解决的重大课题。蚊媒病是通过其传播媒介蚊子传播给人类宿主而引起的。控制蚊媒病在发展中国家仍然是公共卫生事业的主题。目前蚊及蚊媒病的防治对策主要是抗生素、杀虫剂和趋避剂的使用(比如一些控制性试验包括室内喷洒杀虫剂和使用除虫菊酯浸泡过的蚊帐的有效应用)以及对病人的对症治疗等，但是，随着“传统抗生素”的广泛使用，不断产生出诸多新问题抗生素的过敏反应以及长期使用导致抗药菌株的产生；蚊虫抗药性的产生及环境污染等问题；另外，在蚊媒病流行的国家，最穷的地区却受到最严重的侵害，上述的控制措施在这些地区几乎得不到有效的应用并且在很大程度上，杀虫剂耐药的速度已经远远超过了新的杀虫剂生产及上市的速度，因此，开发新型、有效的蚊媒病防治手段至关重要。近期的研究发现，昆虫体内的某些阳离子型多肽具有广谱的抗菌、抗病原活性，这使得病原体能够在一定程度上躲避人类和昆虫免疫系统的杀伤而幸存下来；同时这类多肽还具有“传统抗生素”无法比拟的优越性不会诱导抗药菌株的产生，有希望成为新一代抗菌剂。象其他昆虫一样，对于外来病原的感染，蚊虫也会通过激活其内源的细胞和体液免疫来形成有效的防御系统，这些免疫反应中最重要的一环是激活编码抗病原蛋白或多肽的基因并在其脂肪体中大量表达，目前人们最为关注的是一类富含丝氨酸的多肽——“防御素”，它具有杀灭细菌及潜在的抗疟原虫作用。现代分子生物学和转基因技术的迅猛发展给蚊媒病的防治带来了新的思路，如象转基因羊、转基因鼠那样，将抗病原因子的编码基因转入蚊虫，并在组织或期特异性启动子的驱动下进行表达，表达的抗病原因子就会影响病原在蚊体内的生长发育，阻断蚊媒病的传播，从而达到防治蚊媒病的目的。中华按蚊——作为我国重要的蚊媒病传播媒介，能传播多种疾病，如疟疾、丝虫病等。本专利技术首次克隆出中华按蚊卵黄蛋白原(Vg)启动子和防御素基因的编码序列，并构建出含有Vg启动子、防御素基因、绿色荧光蛋白的表达载体，将该载体通过显微注射的方法转染中华按蚊卵，使防御素基因在Vg启动子的驱动下得到高效表达，从而达到抵抗疟原虫在按蚊体内的生长发育，阻断疟疾传播的作用。本专利技术创造的目的在于由于蚊卵黄蛋白原在蚊吸血后会高效表达，因此其编码基因的启动子序列可以用来驱动防御素基因通过吸血链激活并在其脂肪体(相当于哺乳动物的肝脏)中高效表达，从而影响疟原虫在中华按蚊体内的生长发育，阻断蚊媒传播，达到防治蚊媒病的目的。本专利技术创立了我国重要蚊媒一中华按蚊的转基因体系，为进一步的转基因蚊研究及应用打下了良好的基础。
技术实现思路
转基因蚊是阻断蚊媒病传播的一个重要研究方向，近几年国外学者在埃及伊蚊的转基因研究中已经取得重大进展，但是在按蚊的转基因研究方面尚无成功报道，而国内的转基因蚊研究领域，基本是个空白。本研究在国外成功进行转基因伊蚊研究的基础上，率先建立出我国重要媒介昆虫——中华按蚊的转基因体系，是一项十分有意义的创新性研究，不仅具有重大的理论价值，且具有广阔的应用空间。第一方面.本专利技术提供了一种未知基因的克隆方法； 中华按蚊Vg启动子基因和中华按蚊防御素基因编码序列的克隆，方法包括1、构建中华按蚊基因组文库；2、以中华按蚊基因组文库为模板，设计特异性引物，用PCR的方法扩增出中华按蚊Vg启动子序列；3、提取中华按蚊总RNA，并用AMV逆转录为cDNA；4、以中华按蚊cDNA为模板，设计特异性引物，用PCR的方法扩增出中华按蚊防御素基因的编码序列；第二方面.本专利技术提供了一套表达载体质粒的构建方法；中华按蚊转基因体系表达载体质粒的构建，具体方法如下将扩增出的中华按蚊Vg启动子，中华按蚊防御素基因的编码序列连接到带有绿色荧光蛋白表达基因的载体质粒上，构建出带有Vg启动子，防御素基因及绿色荧光蛋白表达标记物的载体质粒；第三方面.本专利技术提供了一种转基因的方法；中华按蚊转基因体系的转基因方法用显微注射的方法将该表达载体质粒和带有hsp70启动子的帮助载体质粒注射到新鲜产出的中华按蚊卵中，热休克一段时间后取出，孵化蚊卵；第四方面.本专利技术提供了一种转基因体系的定性分析方法；中华按蚊转基因体系的定性分析方法待蚊孵化后，荧光显微镜下观察GFP的表达情况；用RT-PCR等分子生物学方法检测防御素基因的表达情况，对转基因体系进行定性分析；本专利技术根据生物体自身所具备的天然免疫抗菌、抗病原体能力，成功的克隆出新一代抗菌肽——中华按蚊防御素，它有着传统的抗菌素无法比拟的优越性无抗生素耐药、杀虫剂耐药性的产生，无环境污染，能够通过阻断传播媒介达到防治蚊媒病。附图说明图1.pMD18-T-Vg重组质粒的酶切鉴定图1.重组质粒EcoRI/PstI双酶切2.纯化的Vg PCR产物3.分子量标志物图2.pMD18-T-Defensin(267bp)重组质粒的酶切鉴定图1.重组质粒EcoRI/PstI双酶切2.纯化的267bp防御素基因PCR产物 3.分子量标志物图3.267bp中华按蚊防御素基因序列与白纹伊蚊、冈比亚按蚊防御素基因序列比对4.中华按蚊基因组文库巢式PCR扩增结果1、DL1为模板2、以DL2为模板3、以DL3为模板4、以DL4为模板 5、阴性对照 6、阳性对照7、分子量标准图5.中华按蚊防御素cDNA扩增(1)1、以Def 1157-Def 2为引物2、以Def 1394-Def 2为引物3、以Def 1471-Def 2为引物4、阴性对照5、分子量标准图6.中华按蚊防御素eDNA扩增(2)1、以Def 1238-Def 2为引物2、以Def 1275-Def 2为引物3、分子量标准图7.pSL-Vg载体质粒的构建图8.pSL-Vg-Defensin载体质粒的构建图9.Vg-Defensin-GFP表达载体质粒的构建图10.GFP在转基因蚊中的表达图11.中华按蚊转基因体系定性分析1、转基因中华按蚊RT-PCR结果2、分子量标准具体实施方式实例一中华按蚊基因组文库的构建一、中华按蚊基因组DNA的提取取中华按蚊成蚊50只，去足、去翅后，将成蚊加入含有少许液氮的研钵中，快速将成蚊研磨成粉末。待粉末完全解冻后；加入等体积的抽提Buffer I(50mMTris-HCl，pH8.0；5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因，该基因是中华按蚊卵黄蛋白原（Ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ，Ｖｇ）启动子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓光，张亚晶，郑学礼，
申请(专利权)人：陈晓光，张亚晶，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]