一种快速扩增双链RNA靶序列的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速扩增双链ＲＮＡ靶序列的方法，步骤包括：（１）ｄｓＲＮＡ的制备；（２）通过琼脂糖电泳进行割胶回收、分离纯化ｄｓＲＮＡ；（３）根据ＧｅｎＢａｎｋ中的病毒基因组相应序列及其一二级结构特点，运用Ｐｒｉｍｅｒ　　Ｐｒｉｍｉｅｒ５．０软件设计设计获得双链ＲＮＡ的相应引物；（４）以回收后的ｄｓＲＮＡ为模板，添加双链ＲＮＡ的相应引物，在Ｔａｑ酶作用下直接进行ＰＣＲ扩增，获得目的产物。本发明专利技术以ｄｓＲＮＡ作为模板，充分利用了ｄｓＲＮＡ的稳定性；利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶既有反转录酶活性又有ＤＮＡ聚合酶活性的特点，省去了反转录过程；实验所需试剂少，操作简单，所用时间短，达到了省时、省钱、省力的效果。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种快速扩增双链ＲＮＡ靶序列的方法，其特征在于它的步骤为：　　　　（１）ｄｓＲＮＡ的制备：从组织中提取ｄｓＲＮＡ；　　　　（２）通过琼脂糖电泳进行割胶回收、分离纯化ｄｓＲＮＡ；　　　　（３）根据ＧｅｎＢａｎｋ中的病毒基因组相应序列及其一二级结构特点，运用Ｐｒｉｍｅｒ　　Ｐｒｉｍｉｅｒ５．０软件设计设计获得双链ＲＮＡ的相应引物；　　　　（４）以回收后的ｄｓＲＮＡ为模板，添加双链ＲＮＡ的相应引物，在Ｔａｑ酶作用下直接进行ＰＣＲ扩增，获得目的产物；　　　　ＰＣＲ的条件：　　　　反应体系：１．５－２．５Ｕ的Ｔａｑ酶，２５－１００ｎｇ／μＬ的ｄｓＲＮＡ模板０．５μＬ，５－１５μＭ的上游引物０．５－１．５μＬ，５－１５μＭ的下游引物０．５－１．５μＬ，１０倍Ｂｕｆｆｅｒ２－５μＬ，２．５μＭ的ｄＮＴＰ１．６－３．２μＬ，用ｄｄＨ↓［２］Ｏ补足２０－５０μＬ；　　　　反应条件：　　　　采用温度梯度ＰＣＲ仪，对靶序列扩增时的退火温度条件进行摸索；预变性５分钟以后，选择以下几个反应条件中的一个条件：　　　　９４℃１ｍｉｎ、５０．２℃３０ｓ、７２℃１ｍｉｎ、３５个循环、７２℃延伸１０ｍｉｎ；　　　　９４℃１ｍｉｎ、５２．６℃３０ｓ、７２℃１ｍｉｎ、３５个循环、７２℃延伸１０ｍｉｎ；　　　　９４℃１ｍｉｎ、５４．９℃３０ｓ、７２℃１ｍｉｎ、３５个循环、７２℃延伸１０ｍｉｎ；　　　　或９４℃１ｍｉｎ、５６．７℃３０ｓ、７２℃１ｍｉｎ、３５个循环、７２℃延伸１０ｍｉｎ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈集双，唐香山，竺锡武，陈绍宁，刘伟侠，廖乾生，冯俊丽，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]