本发明专利技术涉及一种测定脂解酶活性的方法，其包括测定脂解酶与底物间的酶促反应的气相ｐＨ值，其中底物包含位于Ｃ１－Ｃ１０羧酸和醇之间的酯键。此外，还涉及一种从多肽文库中筛选所需脂解酶的方法，在所述方法中包括了文库检测。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种测定脂解酶活性的方法，以及利用此方法从多肽文库中筛选所需脂解酶的方法。
技术介绍
脂解酶是一类能水解酯键的酶，其广泛用于各种工业中，例如去污工业和烘烤工业。有很多不同的检测脂解酶活性的方法是公知的，例如Gupta R et al.，2003，Biotechnol.Appl.Biochem，37，63-71综述了这些方法。由于对新的和/或旧脂解酶的变异体，特别是一些适合于工业应用的脂解酶的持续需求，新的能检测所述酶活性的分析方法也变得必要。专利技术概述本专利技术提供了一种测定脂解酶活性的方法，该方法包括检测脂解酶与底物间的酶促反应的气相pH值，其中底物含有位于C1-C10羧酸与醇之间的酯键。另外，本专利技术提供了一种从多肽文库中筛选所需脂解酶的方法，该方法包括a)检测文库中的多肽与底物间的酶促反应的气相pH值，其中，该底物包含位于C1-C10羧酸与醇之间的酯键b)挑选所需脂解酶专利技术详述定义本专利技术上下文中的术语“多肽”意欲包括寡肽、多肽和类似的蛋白质。本专利技术上下文中的术语“亲本(parent)”理解为修饰后能产生蛋白变异体的蛋白。亲本蛋白可以是天然形成(野生型)的多肽，或者是通过任意合适方法制备的天然存在多肽的变异体。举例来说，亲本蛋白可以是天然存在蛋白的变异体，其可通过取代、化学修饰、缺失或截断天然存在多肽的一个或多个氨基酸残基得到修饰，或者通过在天然存在多肽的氨基酸序列上增加或插入一个或多个氨基酸残基的方式得到修饰。本专利技术上下文中的术语“变异体”理解为与亲本蛋白相比有一个或多个氨基酸残基被修饰的蛋白。本专利技术上下文中的术语“修饰”或“修改”理解为包括蛋白的化学修饰和编码蛋白的DNA的遗传操作。修饰可以是在所需氨基酸处或其内的氨基酸侧链的置换、取代、缺失和/或插入。因此，术语“修饰的蛋白”理解为包含相对于亲本蛋白的修饰的蛋白。脂解酶/所需脂解酶本专利技术中的脂解酶/所需脂解酶是指能够水解酯键的脂解酶。举例来说，这些酶包括诸如三酰甘油脂酶(EC 3.1.1.3)、脂蛋白脂酶(EC 3.1.1.34)、甘油单脂脂酶(EC 3.1.1.23)、溶血磷脂酶和酯酶(EC 3.1.1.1，EC 3.1.1.2)的脂酶。括号中的字符是国际生物化学联合会酶学委员会(Enzyme Commission of the International Unionof Biochemistry)根据酶的催化活性种类编排的系统分类号。脂解酶/所需脂解酶可以是原核生物酶，具体而言是细菌酶，比如，来自假单胞菌属(Pseudomonas)的酶类。这样的例子有假单胞菌脂酶，例如来自洋葱假单胞菌(P.cepacia)(US 5,290,694，pdb file 1OIL)，荚壳假单孢菌(P.glumae)(N Frenkenet al.(1992)，Appl.En-vir.Microbiol.58 3787-3791，pdb files 1TAH和1QGE)，类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 334 462)和假单孢菌属的菌株(Pseudomonassp.Strain) SD 705(FERM BP-4772)(WO 95/06720，EP 721 981，WO 96/27002，EP 812 910)的假单胞菌脂酶。荚壳假单孢菌的脂酶序列与粘稠色杆菌(Chromobacterium viscosum)(DE 3908131 A1)的氨基酸序列一致。其它例子有细菌角质酶，例如来自假单胞菌，如门多萨假单孢菌(P.mendocina)(US 5,389,536)或恶臭假单孢菌(P.putida)(WO 88/0936)的细菌角质酶。可选择地，脂解酶/所需脂解酶可以是真核生物酶，例如真菌脂解酶，如腐质酶科(Humicola family)和接合菌科(Zygomycetes family)脂解酶，和真菌角质酶。真菌角质酶的例子有茄病镰孢(Fusarium solani)pisi角质酶(S.Longhi等，Journal of Molecular Biology，268(4)，779-799(1997))和Humicola insolens(US5,827,719)角质酶。脂解酶的腐质酶科由来自H.lanuginosa菌株DSM 4109的脂肪酶和与该脂肪酶具有50％以上同源性的脂肪酶组成。来自H.lanuginosa(与Thermomyceslanuginosus同义)的脂酶在EP 258 068和EP 305 216中被描述，并且具有US5,869,438的SEQ ID NO2的1-269位显示的氨基酸序列。腐质酶科也包括下列脂解酶来自沙门氏柏干酪青霉(Penicillium camembertii)(P25234)的脂酶，来自尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)(EP 130064，WO 98/26057)的脂酶/磷脂酶，来自异孢镰孢(F.heterosporum)(R87979)的脂酶，来自臭曲霉(Aspergillus foetidus)(W33009)的溶磷脂酶，来自米曲霉(A.oryzae)(JP-A10-155493)的磷脂酶A1，来自米曲霉(D85895)的脂酶，来自黑曲霉(A.niger)(Y09330)的脂酶/阿魏酸酯酶，来自塔宾曲霉(A.tubingensis)(Y09331)的脂酶/阿魏酸酯酶，来自塔宾曲霉(WO 98/45453)的脂酶，来自黑曲霉(WO 98/31790)的溶血磷脂酶，来自茄病镰孢(F.solanii)的具有6.9的等电点和表观分子量为30千道尔顿的脂酶(WO 96/18729)。接合菌家族包括与Rhizomucor miehei(P19515)脂酶具有至少50％同源性的脂酶。该家族也包括来自反射犁头霉(Absidia reflexa)，A.sporophora，伞枝犁头霉(A.corymbifera)，A.blakesleeana，A.griseola(在WO 96/13578和WO 97/27276中都有描述)和米根霉(Rhizopus oryzae)(P21811)的脂酶。括号中的字符表示在EMBL，GenBank，GeneSeqp或Swiss-Prot数据库中的出版号或登记号。多肽文库本专利技术还涉及一种从多肽文库中筛选所需脂解酶的方法。本专利技术上下文中的术语“多肽文库”理解为至少是两种不同的多肽的集合，即至少含有两种有一个或多个不同氨基酸位点的多肽，例如，多肽中的氨基酸数目可不同或者某一特定位点的氨基酸可不同。通常，可以通过在可表达多肽的宿主细胞中导入编码多肽文库的核酸序列来制备多肽文库。由于遗传密码简并性，该文库中的不同核酸序列的数目可能多于不同多肽的数目。具体而言上述核酸序列文库可以编码亲本脂解酶的变异体，即与亲本脂解酶相比至少有一个氨基酸位点不同的多肽。因而筛选的方法可以用来筛选亲本脂解酶的变异体。这些变异体可以通过例如随机或定点突变亲本脂解酶或其他本领域技术人员公知的方法获得。因而在一个具体实施方案中，多肽文库可以是亲本脂解酶变异体的文库。合适的亲本脂解酶的例子包括但不限于前面脂解酶部分所提到的。具体而言，亲本脂解酶可以是脂酶(Lipol本文档来自技高网...
【技术保护点】
测定脂解酶活性的方法，其包含测定脂解酶与底物间的酶促反应的气相ｐＨ值，其中底物包含位于Ｃ１－Ｃ１０羧酸和醇之间的酯键。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：马茨E比约恩瓦德，格诺特阿贝尔，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]
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