用于核酸长程序列分析的方法技术

本发明专利技术提供一种通过下述步骤对目标核酸测序的方法：使目标核酸断裂；将片段与捕获寡核苷酸的阵列杂交；测定所述杂交片段的质量；和由所述质量测量值构建所述目标核酸的核苷酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供一种核酸分析方法。
技术介绍
分析各种生物聚合物结构是医药和研究中极其重要的方面。分子遗传学取决于DNA或RNA分子的核苷酸序列的知识。蛋白质的氨基酸序列提供可用于研究蛋白质功能和调控的信息。存在多种用于分析生物聚合物序列的策略。确定核酸序列的最常用的方法，双脱氧法(dideoxy method)，包括建立四组在四个碱基的每一个处终止的DNA分子的子序列；通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(gel electrophoresis，PAGE)分离所述片段；和读取所得谱带以确定所述序列。凝胶电泳可能较慢且存在错误。已提出的用于克服凝胶电泳测序的缺点的方法是一种称为杂交测序的方法，例如参看Bains和Smith，J，Theoret.Biol，135303-307(1998)；Lysov等人，Dokl.Acad.Sci.USSR3031508-1511(1988)；Drmanac等人，Genomics4114-128(1989)；Pevzner，J，Biomolec.Struct.Dynamics7(1)63-73(1989)；Pevzner和Lipschutz，Nineteenth Symp.on Math.Found.of Comp.Set，LNCS-841143-258(1994)；Waterman，Introduction to Computational Biology，Chapman和Hall，London，1995。杂交测序(Sequencing by hybridization，SBH)是一种使短核苷酸序列(探针)的阵列(SBH芯片)与目标DNA序列(复制品)的溶液接触而进行的DNA测序技术。生化方法确定与目标序列结合的探针子集(所述序列的图谱)，并且使用组合方法由所述图谱重建DNA序列。由于技术上限制SBH芯片上探针的数目，因此具有挑战性的组合问题在于设计出可对指定长度的任意随机DNA链测序的最少探针组。SBH的实施使用了“经典”探测流程，即，芯片提供所有4kk-mer寡核苷酸(无间隙的“实心”探针)，所述符号为众所周知的DNA碱基{A、C、G、T}；且k为与技术相关的整数参数。据说，“杂交测序的主要问题在于，可靠地检测正确的双链体并使其与含有错配碱基对的双链体相区别(he main challenge for sequencing by hybridizationis to reliably detect the perfect duplexes and discriminate them from duplexes containingmismatched base pairs)”(Chechetkin等人，J. of Biomolecular Structure & Dynamics18(1)83-101(2000))。因此，杂交测序方法力图避免和最小化碱基对错配，碱基对错配将导致假阳性或假阴性结果，最终将导致测序方法的失败。SBH方法依靠避免错配杂交来排除假阳性和/或假阴性读数。因此，需要允许错配杂交而获得新生核酸序列信息的基于杂交的方法。由此，在本文的众多目的中，一个目的在于提供允许错配杂交而获得新生核酸序列信息的方法。
技术实现思路
本文所提供的方法为允许错配杂交而获得新生核酸序列信息的方法。本文提供用于核酸序列分析(包括从头测序)的方法，其包含产生目标核酸的重叠片段；在不排除错配杂交的条件下，使所述片段与固体载体上的捕获寡核苷酸阵列杂交以形成所捕获片段的阵列；通过例如质谱分析法测定其质量来确定所述阵列中每一位点处所捕获片段的质量；和由从各阵列位置获取的一组质量信号构建所述目标核酸的核苷酸序列或一组核苷酸序列。本文还提供对核酸测序的方法，其包含产生目标核酸的重叠片段；使所述片段与固体载体上的捕获寡核苷酸阵列杂交以形成所捕获片段的阵列，其中至少一分组所述捕获寡核苷酸为部分简并寡核苷酸；通过例如质谱分析法测定其质量来确定所述阵列中各位点处所捕获片段的质量；和由从各阵列位置获取的一组质量信号构建所述目标核酸的核苷酸序列或一组核苷酸序列。在一实施例中，所述重叠片段是随机产生。使用本专利技术的方法由样本所获得的序列信息可用于基因分型和单倍体分型、多重基因分型和单倍体分型、核酸混合物分析、长程再测序、序列变异和突变的长程检测、多重测序、长程甲基化模式分析、生物体鉴定、病原鉴定和分型等。因此，本文所提供的方法有利地合并基于固相杂交的方法与基于算法的杂交产物组成分析，以显著增强使用质谱法进行的基于固相杂交的序列分析。本文所提供的方法的一个优势在于，可达成与前述方法相比显著增加的目标核酸序列读取长度的数量和准确性。较高(长程)序列读取长度是使用经非特异性切割或部分特异性切割并随后与固相上的捕获寡核苷酸结合的目标核酸的质谱分析实现，部分或全部所述捕获寡核苷酸可为部分简并寡核苷酸。例如，本文所提供的方法能够在一个反应/实验中对至少250个、500个、600个、700个、800个、900个、1,000个、1,500个、2,000个、3,000个、4,000个、5,000个、6,000个、7,000个、8,000个、9,000个、多达10,000个或更多个核苷酸测序。为实现这一目标，最终定制所产生的供本文所提供的方法分析的片段以便提供较大目标核酸的序列。在另一实施例中，通过本文所提供的方法对多种具有较短长度的较短目标核酸片段进行测序或分析。当已知特定序列的一部分时，这些多重较短序列组(例如)可用于再测序方法中。这些多重较短序列组也可用于多重基因分型、单倍体分型、SNP和甲基化检测方法中。所述片段可通过整体或部分非特异性切割和/或通过部分特异性切割产生，并且通常获得重叠片段以供分析。可使用单一非特异性切割反应和/或互补或部分碱基特异性切割反应获得重叠片段，从而获得相同目标生物分子序列的其它重叠片段。切割方式可为酶切割、化学切割、物理切割或其组合，并且通常产生重叠片段。因此，视选择用于产生重叠片段的特定方法而定，所述重叠片段可为随机产生或不为随机产生。可使用此项技术中已知的方法测定经切割和未经切割的目标序列片段的质量，所述方法包括(但不限于)质谱法和凝胶电泳法。在典型实施例中，使用MALDI-TOF质谱法测定所述片段的质量。用于进行高通量质谱分析的芯片和试剂盒可从SEQUENOM，INC以商标MassARRAY7购得。用于本文中的另一示范性芯片为2002年4月11日申请的相关美国申请案第60/372,711号、2003年3月24日申请的第60/457,847号和2003年4月11日申请的第10/412,801号中所述的“h芯片(h-chip)”，所述专利全部并入本文用作参考。因此，在一实施例中，本文所提供的方法组合固相杂交与在固相上分选的重叠切割产物的质谱检测和鉴定的高通量。本文所提供的方法也改进鉴定由非特异性断裂或部分特异性断裂所产生的片段信号的准确性和清晰度，并且还通过使用在一个目标核酸或一组目标核酸内重建序列的算法增加这些信号的分析速度。附图说明图1描述重叠片段的产生。图2显示与固体载体上的简并捕获寡核苷酸杂交的多个片段。图3描述对杂交捕获寡核苷酸目标片段双链体进行的“修剪”。具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对目标核酸测序的方法，其包含：ａ）产生目标核酸的重叠片段；ｂ）使所述片段与捕获寡核苷酸阵列在不排除所述片段与所述捕获寡核苷酸的错配杂交的条件下接触；ｃ）通过质谱法测量每一个阵列位点处杂交片段的质量；和ｄ）由所述质量测量值构建所述目标核酸的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：迪尔克约翰内斯范登博姆，塞巴斯蒂安伯尔克，
申请(专利权)人：塞昆纳姆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]