本发明专利技术将信号转导基因芯片包括１２０条ＮＦＫＢ介导的信号转导基因，经运用基因芯片技术检测结果显示，Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］可以上调ＮＦＫＢ介导的４１条信号转导相关基因，而麦冬皂苷Ｄ可以下调４７条基因，包括上述的３７条基因，Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］可以下调ＮＦＫＢ介导的信号转导相关的一条基因，而麦冬皂苷Ｄ则可上调该条基因，因而麦冬皂苷Ｄ能对抗Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］对血管内皮细胞的损伤，从而达到保护血管内皮细胞形态及功能的完整性，这是防治心脑血管病症的重要环节。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及麦冬皂苷D在制药中的新用途，具体地说是涉及麦冬皂苷D在制备调控血管内皮细胞周期基因药物中的应用，属中药
技术介绍
1.麦冬通过保护血管内皮细胞来完成养阴行血之功效麦冬为临床滋养阴液的常用之品，是养阴生津的代表药物之一。麦冬，百合科植物麦冬Ophiogon japonicus(Thumb.)Ker-Gawl.的干燥块根。主要含多种糖甙麦门冬皂苷B、D，23，24二羟基罗斯考皂，麦冬甙元-3-O-a-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖甙，甲基麦冬黄烷酮A、B，麦冬黄烷酮A、B，6-醛基异麦冬黄烷酮A、B，麦冬甙元，丙三醇以及β-谷甾醇、豆甾醇。另含挥发油，从中分得长叶烯、α-广藿香烯、β-广藿香烯、香附子烯、愈创奥烯、α-律草烯、樟脑、芳樟醇等成分。麦冬始载于《神农本草经》，味甘、微苦，性微寒，归肺、胃、心经。具有养阴生津、润肺清心的功效。前期研究发现养阴代表中药麦冬的药物血清胚层有效部位群/组分/成分，具有不同程度的保护血管内皮细胞的作用，其中正丁醇部位的药效作用更为显著，以标准品麦冬皂苷D为对照进行高效液相分析发现，其中含有麦冬皂苷D成分。2.麦冬皂苷D的研究进展沿阶草属麦冬主产于四川绵阳，三台和浙江慈溪，萧山等地。杭麦冬与川麦冬的总皂苷的含量差异与栽培年限相关，杭麦冬生长周期为2～3年，川麦冬的栽培期为1年。不同产地麦冬的单体成分麦冬皂苷B、D含量也有较大差别，杭麦冬主含麦冬皂苷B、含少量皂苷D；而川麦冬主含麦冬皂苷D、含少量皂苷B。研究发现麦冬皂苷D可显著抑制静脉血栓模型大鼠早期外周血中性粒细胞活化、粘附；减轻血栓重量；降低血清sICAM-1含量；其副作用低；麦冬皂苷D还可下调大鼠静脉血栓部位TF蛋白表达，并抑制MAPKp38和JNK磷酸化，提示麦冬皂苷D可通过影响上述信号通路，降低炎症反应，抑制血栓形成。另麦冬皂苷有显著性的抗炎作用，鲁斯可皂苷元和麦冬皂苷D为其中的两种活性成分。同种不同产地样品中麦冬皂苷D的含量有较大差别，浙江产麦冬含量较低，四川产麦冬含量较高。对浙江产麦冬、四川产麦冬不同批次样品测定，发现麦冬皂苷D的含量差别较大，且同一产地浙江产麦冬中麦冬皂苷D的含量相差更大。生长年限对麦冬皂苷D的含量有一定的影响，年限长，含量略有增加。因此麦冬皂苷D含量的高低仅仅可作为川麦冬质量指标，而不适合作为浙麦冬质量的指标。由于皂苷为一类极性较大，结构复杂的化合物，它无紫外吸收，无专一显色剂，再加上麦冬皂苷测定经常受糖的干扰，若采用紫外检测末端吸收法，则灵敏度低，且有干扰峰，无法使用。因此，我们采用比色法测定麦冬总皂苷含量为0.2855％，利用HPLC-ELSD法测定麦冬皂苷D的含量为0.03229％。为进一步获取其内在成分的信息，我们进行了ESI-TOF-MS测试，以ESI正离子为麦冬皂苷主要电离方式，乙腈-水梯度洗脱，205nm为检测波长提取紫外色谱图，确定35.52min为麦冬皂苷D，其裂解方式为先脱去与岩藻糖(1→2)连接的鼠李糖及(1→3)连接的木糖，后脱去岩藻糖。采用两种测试方法全面综合分析麦冬皂苷D。3.麦冬皂苷D的提取分离取5~10目麦冬药粉，加10倍量70％乙醇，热回流提取3次，每次2h。合并提取液，减压浓缩至无醇味。然后，将其溶于1000mL水中，用3倍量乙酸乙酯振摇提取3次，得到乙酸乙酯提取物和水层。将水层继续用3倍量正丁醇振摇提取3次，得到正丁醇提取物和水层，合并正丁醇液，用0.1mol/L NaOH振摇提取2次，弃去0.1mol/L NaOH。将正丁醇提取物进行大孔树脂柱洗脱，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、60％乙醇、95％乙醇和乙醇梯度洗脱，分别得到相应的洗脱物。60％乙醇洗脱物经硅胶柱色谱，水饱和正丁醇洗脱，得到麦冬皂苷D。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供麦冬皂苷D在制药中的新用途，具体地说是提供麦冬皂苷D在制备调控血管内皮细胞信号转导基因药物中的应用。保护血管内皮细胞是防治心脑血管病症的重要环节血管内皮细胞(vascular endothelial cell，简称VEC)能合成多种血管活性物质，对血管的舒缩功能与血液的流动性有着不可替代的调节作用。血管内皮并非单纯的衬里，它有着活跃的生理功能。如对凝血和抗凝；纤溶抗纤溶；血小板聚集和抗聚集；白细胞粘附和抗粘附；血管舒缩以及平滑肌细胞间的调控(促增殖和抗增殖)都处于动态平衡状态，一旦受到损伤则失去平衡，有的学者称之为内皮功能障碍(Endothelial dysfunction)，是促进形成早期动脉粥样硬化的始动因素，也是目前研究的热点。VEC生理功能的动态平衡是维持血行正常的重要条件。因此，当VEC受到损伤时，不仅自身的生理功能被破坏，而且还会激活多种凝血和促凝因子，致使血液成分改变和粘度增高，导致血液速度减慢或出现旋涡，从而易于产生血瘀。VEC可因诸多因素受损，主要包括自由基、炎症介质、内毒素等。这些致病因素作用于VEC，可直接加速其凋亡而引起功能失衡，最终引起促栓作用形成微血栓而引发、加重心脑血管疾病。可见，VEC损伤心脑血管疾病中占有非常重要的地位。所以改善和保护血管内皮细胞形态及功能的完整性，是预防和治疗心脑血管疾病的重要着眼点。本专利技术运用基因芯片技术，将人NFkB信号转导基因芯片包括120条NFkB介导的信号转导通路基因。即编码Rel，NFkB，and IkB家族、NFkB应答基因、胞外激活配体与受体的基因、传导信号的激酶与转录因子、可能与病毒复制、自身免疫疾病、炎症反应、肿瘤发生与凋亡调节有关的NFkB介导的信号转导基因。检测结果显示H2O2可以上调NFkB介导的41条信号转导通路相关基因，而麦冬皂苷D可以下调47条基因，包括上述的37条基因。H2O2可以下调NFkB介导的信号转导通路相关的一条基因NALP12，而麦冬皂苷D则可上调该通路相关的一条基因TBK1，从而达到保护血管内皮细胞形态及功能的完整性。具体实施例方式实施例麦冬皂苷D调控血管细胞信号转导基因的研究从中药麦冬提取分离的有效成分麦冬皂苷D对人脐静脉血管内皮细胞有抗H2O2所致凋亡的作用。本专利技术运用基因芯片技术，针对血管内皮细胞信号转导相关基因，发现了麦冬皂苷D所调控的血管内皮细胞基因表达谱。1材料与方法1.1主要试剂RPMI-1640培养基(GIBCO，USA)(每升含20％小牛血清、L-谷氨酰胺0.33mg、青霉素100u、链霉素100u、pH-7.4)；消化剂为0.25％胰蛋白酶(MERCK，USA)；四川绵阳产麦冬，购自南京市药材公司，经南京中医药大学中药鉴定教研室鉴定为Ophiopogon japonicus.(L.f.)Ker-Gawl.的块根。RNA抽提试剂TRIZOL试剂(Invitrogen life technologies)，氯仿，异丙醇，75％乙醇(以DEPC处理的水配制)，无RNA酶的水，无RNA酶的糖原(Invitrogen life technologies)。RNA质量检测试剂TE10mM Tris-HCl pH8，1mM EDTA，0.4M MOPS，pH7.0，0.1M乙酸钠，0.01M EDTA，甲醛，甲醛上样染液(ambion)，溴化乙锭(Ethidiu本文档来自技高网...
【技术保护点】
麦冬皂苷Ｄ在制备调控血管内皮细胞信号转导基因药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张旭，陆兔林，蔡宝昌，王明艳，毛春芹，张小燕，张志洁，杨进，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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