华南沿海七种巨蛎属牡蛎的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ鉴别方法技术

对华南沿海七种巨蛎属牡蛎的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ鉴别方法，首先利用大量测序的华南地区牡蛎种类的１６Ｓ　　ｒＤＮＡ和ＣＯＩ序列，通过ＤＮＡｓｔａｒ中的ＭａｐＤｒａｗ软件分析，选取适合的内切酶组合；随后进行基因组ＤＮＡ提取和目的片段的ＰＣＲ扩增，最后利用选取的内切酶对ＰＣＲ产物酶切和琼脂糖凝胶电泳检测，结果与标准带谱进行对比，判定结果；它适用范围广，操作简单，对仪器设备要求低，检测快速，更准确，相比形态学方法可靠性高。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种对华南沿海七种巨蛎属牡蛎的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ鉴别方法，其特征是首先利用大量测序的华南地区牡蛎种类的１６ＳｒＤＮＡ和ＣＯＩ序列，通过ＤＮＡｓｔａｒ中的ＭａｐＤｒａｗ软件分析，选取适合的内切酶组合；随后，进行基因组ＤＮＡ提取和目的片段的ＰＣＲ扩增；最后利用选取的内切酶对ＰＣＲ产物酶切和琼脂糖凝胶电泳检测、证实，具体步骤如下：（１）选取内切酶组合对华南沿海巨牡蛎属种类，根据其已获得的１６ＳｒＤＮＡ和ＣＯＩ序列，通过ＣｌｕｓｔａｌＷ进行序列比对发现和检测不同种类间序列的差异，应用ＭａｐＤｒａｗ软件分析，选出内切酶组合，其中对１６ＳｒＤＮＡ片段挑选出ＤｄｅⅠ／ＤｒａⅠ和ＡｌｕⅠ／ＭｓｅⅠ两组双酶切组合，对ＣＯＩ序列片段挑选出ＮｉｓⅠ／ＡｌｕⅠ和ＮｉｓⅠ／ＤｄｅⅠ两组双酶切组合；（２）基因组ＤＮＡ提取Ａ．取闭壳肌组织０．１克，加入７００ｕｌ抽提缓冲液中在３７℃下消化过夜；Ｂ．用等体积的比例为２５∶２４∶１的酚－氯仿－异戊醇混合液，充分振荡混匀，１２０００ｇ／分，离心１０－１５分钟；Ｃ．取上清液，重复步骤Ｂ；Ｄ．加入等体积的氯仿，混匀，１２０００ｇ／分，离心５－１０分钟；Ｅ．取上清液，加入２倍体积的无水乙醇和１／１０体积３Ｍ的乙酸钠；Ｆ．１２０００ｇ／分，离心１２－２０分钟，去上清液，７０％乙醇洗涤１－２次；Ｇ．让乙醇彻底挥发，将基因组ＤＮＡ沉淀溶于５０ｕｌ无菌纯净水，即得基因组ＤＮＡ，４℃保存备用；（３）目的片段ＰＣＲ扩增ＰＣＲ反应体系为５０ｕｌ，包含５ｕｌ１０×ｂｕｆｆｅｒ，０．６ｕｌ２．５Ｕ／ｕｌＴａｑ酶，１００ｎｇ基因组ＤＮＡ，引物为０．２ｕＭ，ｄＮＴＰ为０．２ｍＭ，Ｍｇ↑［２＋］为２ｍＭ；ＰＣＲ反应条件为，先预变性９４℃２分钟，而后进行９４℃变性４５秒，对ＣＯＩ４８℃或对１６Ｓ５０℃复性１分钟和７２℃延伸１分钟，共进行３５个循环，最后７２℃延伸７分钟，得扩增样品；扩增１６Ｓ和ＣＯＩ基因片段两对通用的引物分别为：１６ＳａｒＬ／１６ＳａｒＨ：５′－ＣＧＧＴＧＴＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＣＡＴ－３′／５′－ＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＣＡＣＧＴ－３′；ＣＯＩＬ１／ＣＯＩＨ：５′－ＧＧＴＣＡＡＣＡＡＴＣＡＴＡＡＡＧＡＴＡＴＴＧＧ－３′／５′－ＴＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＡ－３′；（４）酶切反应应用ＤｄｅⅠ／ＤｒａⅠ和ＡｌｕⅠ／ＭｓｅⅠ两组酶对１６ＳｒＤＮＡ扩增片段分别进行双酶切反应，反应体积为２０ｕ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：喻子牛，夏建军，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]