平行制备核酸及应用制造技术

本发明专利技术涉及到基因组学、合成生物学和遗传工程等领域。本发明专利技术特别涉及到在固相表面平行多链体连接和扩增的方法，用于制备生物应用的核酸组装体及分析各种生物样品，例如ＤＮＡ、ＲＮＡ、和蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及到基因组学、合成生物学和遗传工程等领域。本专利技术特别涉及到在 固相表面平行多链体连接和扩增的方法，用于制备生物应用的核酸组装体及分析各种 生物样品，例如DNA、 RNA、和蛋白质。
技术介绍
本专利技术涉及到核酸
，特别是制备和应用已知序列的核酸。目前来说， 生物科学和技术的主要进展是基于基础分子科学在基因组水平上的科研和应用。因此 需要更快，更经济，更好的实验工具来满足日益增长的科研需要。在基因组和蛋白质 组学研究领域，传统的分子生物学技术已经飞速朝着微型化、平行化、自动化技术发 展。传统的单个实验现在可以使用自动机械操作，在96或384微孔板平行进行。这 些实验只需微摩尔级别的材料和毫升级别的溶液。然而，现有的进展仍然不能满足大 规模的应用，如基因组水平的研究或大量样品的处理。因为此类大规模实验需要成千 上万的测试，这些测试用价昂贵和消耗大量的时间(几个月到几年)。对人群进行基 因组水平的单核苷酸多态性分析(SNP)就是其中一例，此实验能够提供对于预测和 预防遗传病及对生命有威胁疾病的分子诊断，例如癌症的诊断，的宝贵信息。如果对 每个人的每个多态性位点进行一次测试，使用10mL溶液，如有100,000个多态性位 点和l，OOO个人，那么单溶剂的消耗量达l，OOO,OOO升，相当于一个小型化工厂的年 产量。另一个例子，如合成寡核苷酸的基因并组装成基因也显示了当前常规方法的不 足之处。 一个小型基因组一般由几千个基因组成，包括大约5百万个碱基对。单考虑 溶剂，若传统的方法的一个合成循环需要消耗5mL的溶剂，获得这个基因组的寡核 苷酸就需要消耗50,000升溶剂。基于这种水平的材料消耗，在基因组水平上进行研 究很显然是不切实际。这样大规模的实验需要大量的器械和充足的空间来处理和储存 试剂。整个过程还要耗费大量的劳力、时间而且容易出错。为了克服这些问题急需发 展新技术来减少试剂的消耗量，将微摩尔(固体)或毫升(液体)的用量降低1000 倍或更多。这样的新技术的优势是显而易见的，包括用于基因组水平的实验研究，加 速错综复杂的生物细胞系统的理解，有助于发现新的调控机理，同时节约自然资源。 在材料和时间的节约就意味着，因而对环境友好，也在经济上可行。 本专利技术的目标之一是合成大片段DNA。大片段DNA可以是完整的基因或基因 的一部分，或是任合部分的染色体DNA或生物源DNA，也可以是任何任意序列组成 的DNA。 DNA序列信息和强大的计算方法使得改造DNA序列成为可能。这些序列 可以模仿或改造大量转录RNA和蛋白质的功能和作用。这个初成的领域称作合成生 物学，它包括构建DNA文库来转录RNA或表达蛋白质/抗体和多肽，使生化、农业 和环境领域受益。合成生物学也包括构建完整基因组来制备RNA和蛋白质，并能组 装成生物分子复合物、生物信号传导系统、有机体和细胞。采用当前的DNA合成方 法完成从寡核苷酸组装成长链核酸是非常昂贵并且速度较慢，或者仅限于组装消化后 的散乱的天然DNA片段(Stemmer, 1994)。分子生物学家已经用寡核苷酸组装成DNA来生成天然基因、突变基因(切断、 融合、插入/缺失)、杂合基因、转基因等(Dillonetal.， 1990; Stemmeretal., 1995; Auet al., 1998)。合成的基因通常长度为1，000碱基对(lkbp)或者更长， 一般是通过在溶 液中连接30-80 bp的寡核苷酸文库一次组装完成一个基因。根据要组装的DNA信息 专门设计寡核苷酸，并在固相表面进行化学合成，如在可控制的多孔玻璃(CPG)进 行化学合成，然后通常在没有纯化步骤的情况下，这些寡核苷酸被组装成长DNA片 段。基因的组装过程需要完成两项任务(1)寡核苷酸退火和杂交形成一个双链复合 物；(2)通过连接反应使这些寡核苷酸形成长链共价相连的的核苷酸。作为选择地， 寡核苷酸双链复合体包含重叠区域，通过聚合酶链式反应(PCR)可以延伸成长链产 物。当前的基因合成方法在杂交、连接和PCR步骤的次序上稍有不同，但都局限于 小片段的基因合成。当前的一种合成方法是根据感兴趣的DNA合成一套寡核苷酸， 并在连接酶和聚合酶的作用下同时进行连接和PCR过程(e.g. ligation chain reaction (LCR))。在这个过程中，中等长度的DNA片段先生成，并在随后的重叠融合PCR中 产生全长的DNA。该方法已经用于合成5.4 kbp噬菌体基因组(Sm他et al., 2003)和7.5 kbp脊髓灰质炎病毒基因组(Cello et al., 2002)。另一个方法(U.S. Pat. Nos. 6,521,427和 U.S. Pat No. 6,670,127)是将合成双链聚核苷酸，包括将不同的双链复合物连续变性退 火产生长链双链DNA，其中的缺刻位点再通过连接酶连接。总体来说，当前的DNA 合成方法在一个组装反应中只能产生一个序列，因此整个过程比较缓慢且成本较高。历史上，寡核苷酸的合成并不是为了高通量平行应用而开发，而仅是用于单个 序列核酸的应用。今天，寡核苷酸的合成基本上还是靠一个个碱基的合成。用当前的 方法进行高通量合成受到合成速度和成本的限制，大约每天只能合成40,000 bp且每 对碱基需要约0.1美金。因此，用寡核苷酸组装一个含5,000个基因，每个基因平均 1,000 kbp，的小型基因组将需要500,000美金和125天的时间(以每天工作24小时计 算)。如果以40-mer寡核苷酸来组装则需要合成250,000条寡核苷酸链。另外，这些 寡核苷酸需要独立完成并根据基因合成的需要保持一定浓度且混合成一个寡核苷酸 库。实验室需要自动液体处理装置和庞大的温控储藏空间来进行整个过程，不大量的 时间和财力被耗费。由于混合的寡核苷酸库易因操作错误并得到不同浓度，在组装中 一个寡核苷酸的缺失就可能导致整个基因合成的失败。假设这些条件都被优化，合成 一个基因中的一对碱基将需要花费大约2美金并且会需要四个星期完成全部合成工 作。当前基于微芯片的DNA寡核苷酸合成技术在合成的通量上得到了极大的提高 (Zhou et al. 2004)。该方法在设计有上千个独立的反应微室的微流体装置中平行合成 上千个寡核苷酸。每个微室的反应体积为皮升数量级，合成的寡核苷酸从表面切下并 混合收集。基于微芯片合成上千个寡核苷酸仅仅消耗常规方法合成一条寡核苷酸所消 耗的试剂。合成后的寡核苷酸收集在一个离心管中，这大大简化了后续寡核苷酸的 应，如进行基因合成。该方法产生的寡核苷酸混合物通过连接反应己经用于构建全 长714 bp的绿色荧光蛋白基因(Zhou et al. 2004)。另一个办法是对寡核苷酸混合物使 用独立的PCR反应，然后通过限制性酶切反应去除引物，扩增的寡核苷酸再经融合 PCR产生21个编码大肠杆菌30S核糖体蛋白的基因，这些基因总共长14.6kbp(Tian et al 2004)。通过杂交的方法纯化这些扩增的寡核苷酸使它们的保真性提高9倍(Tian etal2004)。上述基因合成的方法克服了寡核苷酸合成过程中费时、价格昂贵等的缺点，但 该方法仍不适合同时组装大量基因或DNA片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备核酸的方法，该方法包括：（ａ）在固相表面放置两种或两种以上的捕获探针；（ｂ）将包括两种或两种以上寡核苷酸的混合物添加于固相表面；（ｃ）使寡核苷酸混合物与捕获探针杂交，形成有缺刻位点的杂交复合体；（ｄ）将有杂交复合体中的缺刻位点补平和连接产生核酸聚合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：高晓莲，周小川，张小林，盛苨晶，朱奇，
申请(专利权)人：高晓莲，
类型：发明
国别省市：US[美国]