松材线虫分子检测快速制样方法技术

本发明专利技术涉及一种松材线虫分子检测快速制样方法，是专门针对对林业影响巨大的松材线虫而建立起的快速制样的方法。利用该方法，不需要分离线虫，就可以直接提取疫木中松材线虫ＤＮＡ用于分子检测。配合ＰＣＲ技术，可以检测出１．５克木屑中的１条松材线虫，时间仅需要３ｈ，效果稳定可靠。该方法克服了传统松材线虫检测制样方法时间较长、效果不稳定的缺点；适用于进出口通关木质材料松材线虫的快速检验检疫和林间病害早期诊断中大批量样品的检测。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种松材线虫分子检测快速制样方法，其特征在于，按以下步骤进行：［１］用直径为７～１０ｍｍ的电钻在待测木质材料上钻取木屑，将所得木屑混合均匀，取１～８克木屑放于５～２０ｍｌ离心管中；［２］将裂解液按每克木屑２～３毫升溶液的比例加入步骤［１］的离心管中，６２～６８℃水浴１～２小时；所述裂解液由０．１Ｍ三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ），０．４Ｍ乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ），１％十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）在常温下的混合物，ｐＨ值为８．０；［３］将步骤［２］所得混合液经５０００ｒｃｆ离心１０ｍｉｎ后，将其上清液６００μｌ～１ｍｌ转入另一２～３ｍｌ离心管中，加入一定量的变性液，使变性液的终浓度为４Ｍ，混合均匀后，室温下放置８～１５ｍｉｎ，１００００ｒｃｆ离心８～１０ｍｉｎ后将上清液转入ＤＮＡ吸附柱中，１００００ｒｃｆ离心１～２ｍｉｎ，弃滤液；所述变性液是１２Ｍ异硫氰酸胍；［４］在上一步的ＤＮＡ吸附柱中加入清洗液６００～８００μｌ，１００００ｒｃｆ离心１～２ｍｉｎ清洗ＤＮＡ，弃滤液；所述清洗液是７０％乙醇（Ｖ／Ｖ）；［５］重复步骤［４］一次；［６］再次离心除去所述的清洗液；［７］ＤＮＡ吸附柱中加入溶解液５０～６０μｌ溶解ＤＮＡ，１００００ｒｃｆ离心１～２ｍｉｎ，收集滤液，即为松材线虫ＤＮＡ样品，直接用于ＰＣＲ检测。所述溶解液为超纯水。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：殷幼平，王中康，刘裕兰，袁青，曹月青，夏玉先，彭国雄，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]