本发明专利技术涉及一种基于环介导等温扩增（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）技术的食源性病原体快速检测技术。一种诺如病毒ＧⅡ型检测用引物，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为诺如病毒ＧⅡ型的衣壳蛋白－ＧｅｎＢａｎｋ登陆号：Ｘ８６５５７，所述引物与所述靶基因的５０９５位－５３１９位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明专利技术通过提供一种对诺如病毒ＧⅡ型特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在诺如病毒ＧⅡ型特定基因片段，进而确定标本中是否存在诺如病毒ＧⅡ型。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalampl ification, LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。特别涉及对诺如病毒G II型特定 基因片段具有特异性的引物及引物组；还涉及将所述引物及引物组用环介导等温扩增法检 测诺如病毒G II型的检测方法和检测试剂盒。
技术介绍
食源性疾病发病率较高，由沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，霍乱 弧菌，副溶血性弧菌以及E. coli 0157:H7，轮状病毒以及诺如病毒G II型引起的食物中毒， 其发病率在我国食源性疾病发病率中占非常高的比例，是一个严重的公共卫生问题。目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方 法。病原体分离虽然是金标准，但繁琐费时，一般需要5天时间，最长需要一个月时间，而且 免疫学方法的特异性和敏感性均较低。随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中 国专利公开号CN1526825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌Η 72Η序列的特异性， 通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法。虽然该方 法敏感、准确、快速，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技 术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技术(国际 专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出一种核酸扩增新技术，即针对靶基因 的6个区域设计4条特异引物(如有需要还可以添加有环引物对)，利用一种链置换DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应， 扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测，也 可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色，通过肉眼进行判定。用于LAMP技术扩 增的2对引物乃针对基因6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循 环、其单位时间内扩增效率更高、且不需特殊仪器等优点。但是目前未有利用环介导等温扩 增法检测诺如病毒GII型的检测方法和检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于，提供一种对诺如病毒G II型特定基因片段具有特异性的 引物。上述目的是通过如下技术方案实现的一种诺如病毒G II型检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所 述靶基因为诺如病毒G II型的衣壳蛋白一GenBank登陆号X86557，所述引物与所述靶基 因的5095位一5319位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本专利技术的另一个目的在于，提供一种对诺如病毒G II型特定基因片段具有特异性的引物组。上述目的是通过如下技术方案实现的一种诺如病毒G II型检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成正向外引物F3-G II CGTCGAATGACGCCAACC反向外引物B3-G II CGCTCCACAGTATCTCACCT正向内引物FIP-G 11CGGGCTCCAGAGCCATAACCTCATCTGATGGGTCCGCAG 反向内引物 BIP-G IIGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGGGACACTGTGAACTCTCCA可以扩增诺如病毒G II型的衣壳蛋白(X86557)基因序列的5095位-—5319位 的核酸序列的一部分或其互补链。特别地，为了加快扩增反应速度，所述引物组还可以包括正向环引物LF-G II TTATTGACCTCTGGGACGAGG反向环引物LB-G II GAAACAATTTTGTACAAGCCCCTG本专利技术的另一个目的在于，提供一种利用上述引物或引物组基于环介导等温扩增 法检测诺如病毒G II型的检测方法。上述目的是通过如下技术方案实现的一种诺如病毒G II型的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在诺如病毒G II 型，其特征在于，以诺如病毒G II型的衣壳蛋白(X86557)基因序列的5095位一5319位 的核酸序列的一部分或其互补链为靶，通过LAMP法用上述引物组选择性扩增上述靶区域， 确认是否存在有扩增产物。具体检测方法为1)样品处理和模板提取，样品范围适用于细胞培养上清液、粪便、呕吐物等病毒待 检标本；取粪便、腹泻物用适量生理盐水稀释，离心取上清液用于RNA抽提(QIAamp Viral RNAMini Kit)；2)诺如病毒G II型的环介导等温扩增(LAMP)取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul IOOul的反应体系，混勻点离后在约65°C条件下恒温保温约60-90分钟，然后置于80°C的 环境下2分钟灭活酶。反应体系为(反应总体积20ul IOOul) 3) LAMP反应产物的检测A)肉眼检测与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为 阴性；或，B)加染料后检测每25ul体系的反应管加1000 X SYBR Green I (invitrogen) l_2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，C)电泳检测2_3%琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征 性梯状条带，最小片段在180bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。特别地，为了加快扩增反应速度，所述扩增反应液还可以包括正向环引物LF-G II 0. 6-1. OuM反向环引物LB-G II 0. 6-1. OuM本专利技术的另一个目的在于，提供一种利用上述引物或引物组基于环介导等温扩增 法检测诺如病毒G II型的检测试剂盒。上述目的是通过如下技术方案实现的一种诺如病毒G II型检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有上述 引物或引物组的扩增反应液、酶。所述扩增反应液中包括如下试剂 其中IOXBst DNA Polymerase Buffer 反应缓冲液含有 200mM ρΗ 8. 8 的三羟基 甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl) UOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通 X-100 ；所述酶为包括，每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶和每微升含20个活性单 位的AMV反转录酶。特别地，为了加快扩增反应速度，所述扩增反应液还可以包括正向环引物LF-G II 0. 6-1. OuM反向环引物LB-G II 0. 6-1. OuM所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性 对照模板为诺如病毒G II型基因组cDNA(l IOOnM)。本专利技术通过提供一种对诺如病毒G II型特定基因片段具有特异性的引物组，及其 用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在诺如病毒G II型特定基因片段，进而确 定标本中是否存在诺如病毒G II型。本专利技术检测试剂和检测方法具有敏感性高、特异性强、 方便快捷、不需特殊仪器、适用范围广等优点，可解决食源性病原体的现场快速检测和基层 普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，与现有的PCR方法相比具有特异性 强、敏感性本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诺如病毒ＧⅡ型检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为诺如病毒ＧⅡ型的衣壳蛋白－－－ＧｅｎＢａｎｋ登陆号：Ｘ８６５５７，所述引物与所述靶基因的５０９５位－－－５３１９位的核酸序列的一部分或其互补链互补。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏泉德，张彩虹，谭爱军，张丽荣，
申请(专利权)人：珠海市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]
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