棘皮动物活体取样提取ＤＮＡ的方法技术

本发明专利技术公开一种棘皮动物活体取样提取ＤＮＡ的方法，是取活体海胆的管足或取活体海参的管足、触手或肠，用加有ＤＮＡ酶的裂解液裂解消化，经过萃取、离心取上清液、离心除渣（骨片）、乙醇沉淀、离心分离、检测等步骤，使所提取的ＤＮＡ的浓度与质量，与棘皮动物传统的（死体）取样组织提取的ＤＮＡ一致。无需将棘皮动物杀死，而是在活体上取样，继而提取ＤＮＡ，使分子生物学技术能真正成为遗传育种的辅助工具。利用本发明专利技术，可以合理利用棘皮动物资源，进行辅助育种、养殖状况监测、基因筛选、家系鉴别等工作。另外，对于棘皮动物中很多濒危种的保护和研究，意义也十分重大。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种棘皮动物活体取样提取ＤＮＡ的方法，其步骤如下：ａ．取棘皮动物活体组织至少０．０１ｇ，放入离心管中；ｂ．在盛有棘皮动物样品组织的离心管中，加入２００μｌ裂解液，然后将组织在裂解液中充分剪碎，５０℃消化４５～５５ｍｉｎ，期间每隔１０ｍｉｎ振荡摇匀一次，所述裂解液的组分及终浓度为０．２ｇ／ｌ蛋白酶Ｋ，０．５％ＳＤＳ，１００ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ，０．０５ｇ／ｌＲＮＡ酶；ｃ．在离心管中加入２００μｌＴＥＳ稀释溶液稀释；ｄ．加入２００μｌ的Ｔｒｉｓ－饱和平衡酚和２００μｌ氯仿－异戊醇混合液，萃取１５～３０ｍｉｎ；ｅ．７５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，用粗口枪头移液器抽取上清，将上清液置入另一离心管中；ｆ．重复ｄ、ｅ步骤；ｇ．将萃取之后的上清夜在１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，使用粗口枪头移液器吸取溶液，放入另一离心管中；ｈ．在离心管中，加入两倍于离心管中体积的１００％的－２０℃乙醇，之后放入－２０℃中静置至少４ｈ；ｉ．１２５００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，除去溶液，将离心管倒置在滤纸上，吸干剩液；ｊ．向离心管中加入７０％乙醇８００μｌ，洗涤一次，１２５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，倒掉溶液，室温晾干至少３０ｍｉｎ；ｋ．加入０．１×ＴＥ１００μｌ，轻轻振荡，然后４℃溶解至少４ｈ；ｌ．用１％的琼脂糖凝胶电泳，取２μｌＤＮＡ模板混合２μｌ上样缓冲液在琼脂糖胶上点样进行检测。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：冯志纲，于佳平，丁君，田燚，常亚青，
申请(专利权)人：大连水产学院，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]