一种HBV DNA基因分型荧光PCR多通道检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种ＨＢＶ　　ＤＮＡ基因分型荧光ＰＣＲ多通道检测方法及其试剂盒，其方法特征在于，从ＧｅｎＢａｎｋ中找出已作基因分型的ＨＢＶ　　ＤＮＡ全序列进行序列联配；根据序列联配结果找出ＨＢＶ基因型的型特异性碱基的聚集区域；根据型特异性碱基的聚集区域设计探针及配套的引物，采用多色标记探针在一个ＰＣＲ管中进行多通道基因型和通用型检测，根据型和通用型检测Ｃｔ值的差值，对临床样本中ＨＢＶ病毒中型病毒的比例含量进行判断。本发明专利技术的试剂盒性能稳定、操作简便、检测快速，能很好地判断ＨＢＶ　　ＤＮＡ的型别，有助于更全面的判断慢性乙型肝炎病毒感染者的预后和选择更合适的治疗方案。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学技术，特别是涉及一种乙型肝炎病毒(H印atitis B Virus, HBV)基因分型的荧光PCR多通道检测方法及其试剂盒。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)流行世界各地，估计全球有20亿人感染，其中慢 性感染者3.5亿，我国约占半数，全球每年约有100万人死于HBV感染。此 种感染最终可发展为肝硬化、肝癌，是当前WHO公布的人类疾病死亡原因中 居第九位的疾病。乙型肝炎病毒主要通过宿主免疫机制引起肝脏损害，机体细胞识别病毒 抗原并攻击受感染的肝细胞引起炎症，这个过程受宿主与病毒的多个因素影 响。病毒基因异质性影响着抗原的表达，可能也从中扮演了重要的角色。不 同的毒株出现某些变异的频率不同，不同毒株对机体免疫清除抵抗力不同以 及其它的因素可能导致了不同基因型具有不同的感染后疾病谱，从目前的研 究来看，HBVC基因型与较重的肝脏病变相关，B型则与较轻的病变相关；A 型与慢性肝炎相关，D型与急性自限型肝炎相关；其它基因型与疾病谱的关 系还有待发现。Kao发现C型与重症如肝硬化和肝细胞癌有关，B型多存在于年轻的非 肝硬化患者中。C型患者多是HBeAg(+)并且血清DNA含量高于B型，C型 患者在HBV的免疫淸除阶段血清转化比B型延迟，同时C型比B型有更高 的C基因启动子突变率。在抗病毒治疗中，B型比C型对拉咪呋啶敏感，不过两型产生药抗性的几率是一样的。Mayerat等比较了 35例急性肝炎及30例 慢性肝炎病人中的基因型分布，发现在慢性肝炎组中，A型占80X(28 / 35)， D型占11%(4/35);急性肝炎组D型占80X(24/ 30)， A型占10%(3 / 30)， 提示病毒基因型在病毒一宿主相互作用中有一定差异，这可能是因为基因型A 所产生的抗原性要弱于基因型D,诱导机体产生免疫清除的能力也较弱，导 致感染迁延。Lindh等对东亚地区的43名基因型为C的HBV漫性感染者的 基因型及CP变异的研究表明，T1762变异更易出现在C基因型，感染C型 后更易出现较重的肝脏炎症。对HBV进行基因分型有利于对HBV感染的流行病学、病因学和临床诊 治进行更加深入细致的研究，现有研究表明不同亚型的HBV感染的临床病程 和对治疗的反应都存在着一定的差异。病毒变异是生物遗传进化的基本因素 之一，乙型肝炎病毒变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的， 也可发生于应用药物或接种疫苗后。HBV在复制中利用RNA中间体，病毒 聚合酶和逆转录酶活性是有效而迅速的，病毒聚合酶缺乏校对酶活性，发生 核苷酸替代变异后难以修正。已发现HBV序列的变异在基因组各个区域均可 发生。不同的病人机体和不同的药物与不同的变异毒株长期相互作用表现出 不同的基因型。虽然没有确切数据表明HBV的变异比例，但病毒变异是高频 并永恒的，现在已经由最初的A D四型发展到了 A H八型，病毒与机体的 继续斗争将会出现更多的变异热点和基因型。尽管HBV分型、变异与临床表 征有着一定关联度，但是目前仍然没有完全阐明清楚。大规模的系统流行病 学分子特征普査将更有助人们认识HBV与机体以及药物的辨证关系，这就依 赖于简便快速的HBV基因分型方法。对HBV进行基因分型以及变异检测已成为比较热点的检测，在临床上选 择合适的药物或制订治疗方案等方面都有重要的指导作用。目前临床检测市 场迫切需要有相关成就的技术方案，尤其是针对病毒分子特征以及机理的方 法，可进一步指导乙肝的临床治疗。虽然有很多实验室都在研究HBV基因分 型及变异的检测方法，但国内外市场上还没有检测HBV基因型的临床诊断产口叩o国内外对HBV进行基因分型的方法可分为全基因序列比对和片段基因序 列比对两大类。全基因序列比对是以生物系统发生学中的基因同源性为基础 的，它主要是通过HBV全基因序列测定来进行基因分型，另外，也可应用对 HBV全基因进行限制性片段长度多态性分析技术(RFLP)。片段基因序列比对 是利用HBV中的代表性片段的序列类型来反映全基因序列的类型，主要技术 类型有片段基因序列测定、PCR—RFLP、型特异引物(SSP)扩增法和型特异探 针(SSO)检测法等。序列测定虽然结果准确可靠，但是由于其技术复杂、实验 流程长、实验条件要求高、耗时长和费用昂贵难以作临床常规使用，目前只 作为实验室研究使用；RFLP技术相对简单，但是酶切位点易受基因变异影响， 且遇混合感染或酶切不完全，会出现复杂条带，影响分型结果判断应用SSP 法进行PCR扩增需要多个扩增管，使用常规的PCR后产物电泳的方法也容易 污染，其灵敏性比特异性探针低；应用SSO法可通过对单管的PCR产物进行 检测来分型，因此具有操作相对简单和费用较低等特点，最具有实用价值。 基因芯片技术是近几年发展起来的新技术，也能建立乙型肝炎毒基因分型诊 断的方法，但费用较高，检测时需要昂贵的芯片扫描仪，且检测探针固定技 术、检测灵敏度等关键技术还未取得重大突破，目前尚未见有基因芯片进行 HBV基因分型的产品上市。实时荧光PCR反应是在常规PCR的一对引物之外，加入一个两端带有荧 光标记的寡核苷酸探针。在探针完好的状态下，5'端报告荧光基团的激发光 被3'端的淬灭荧光基团所抑制。PCR反应过程中，随着链的延伸，Taq酶沿 着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，由于它的5' ->3'外切核酸酶 活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一条新生 链，就有一个报告基团的信号释放，被释放的激离报告荧光基团的数目和PCR 产物是一对一的关系。通过荧光PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样 品实际扩增曲线，找到PCR扩增的对数期，可以对样本作定性定量检测。HBV 的变异是不断产生的，目前的分型方法均只能基于现在已取得的研究成果， 分型依据和分型方法均在不断发展中。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种更有效又简便的乙型肝炎病毒基因分型的检 测方法；本专利技术另一目的在于提供用于该方法的检测试剂盒，以克服现有技 术对HBV基因分型检测比较烦琐复杂的缺陷。技术方案为达到上述目的，本专利技术提供的技术方案之一是一种乙型肝炎病毒基因 分型的荧光PCR多通道检测方法，即在聚合酶链式反应中，使用以下结构的 多聚核苷酸序列作为检测探针序列B 5'- CAAAT CTCCA -3'序列C 5'-CGTGTCCTGG-3'序列D 5'-GGCAG AATCT-3'采用包含有上述序列的向5'端或/和3'端延长的序列，只要包含了述分型 特异性序列B、 C和/或D，即可同样达到本专利技术的技术效果；同样，与上述 序列B、 C、 D和包含B、 C、 D的同源性大于75。/。的序列，事实上也可以达 到HBV基因分型的目的，但本专利技术需要指出的是，其替代效果不一定比上述 明确指出的序列更好；同理，不管上述序列B、 C、 D还是包含B、 C、 D的 序列还是同源性大于75%的序列，其碱基互补序列只是碱基形式上的变化， 并未改变本专利技术技术方案的实质性。上述的各种序列还可以经添加互站臂形成分子信标探针，以利用分子荧 光进行HBV基因分型检测，这种分子信标探针是上述各种序列所构成的专利技术 方案的一种合理延伸，也是上述序列的一种理所当然可以利用的方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ基因分型的荧光ＰＣＲ多通道检测方法，其特征在于，在聚合酶链式反应中使用以下结构的多聚核苷酸序列作为检测探针：　　　　序列Ｂ　　５’－ＣＡＡＡＴ　　ＣＴＣＣＡ－３’　　　　序列Ｃ　　５’－ＣＧＴＧＴ　　ＣＣＴＧＧ－３’　　　　序列Ｄ　　５’－ＧＧＣＡＧ　　ＡＡＴＣＴ－３’　　　　或者包含有上述序列的向５’端或／和３’端延长的序列；　　　　或者与上述序列同源性大于７５％的序列；　　　　或者上述序列的碱基互补序列；　　　　或者上述序列经添加互补臂形成的分子信标探针；。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈维祥，廖兴中，吴大治，夏懿，
申请(专利权)人：上海复星医药集团股份有限公司，上海复星医学科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]