抗菌抗结核植物内生菌的分离筛选方法技术

本发明专利技术公开了抗菌抗结核植物内生菌的分离筛选方法，该方法包括抗菌抗结核植物组织的准备、表面消毒与无菌检测、植物内生菌的分离纯化、内生真菌发酵、内生细菌发酵、发酵液的处理、菌体的处理、有效抗菌菌株筛选、有效抗结核菌株筛选和菌种的保存步骤。本发明专利技术为实现从微生物中获取有效抗菌抗结核物质提供了保证，通过本发明专利技术获得一批有效的菌株。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种抗菌抗结核植物内生菌的分离筛选方法，其特征是步骤如下：　　　　（１）抗菌抗结核植物组织的准备：采集植物的根、茎、叶、果实等组织；　　　　（２）表面消毒与无菌检测：在无菌工作台内，将步骤（１）各部分组织用无菌水冲洗３次，采用７５％酒精＋０．１％升汞组合进行表面消毒，无菌水冲洗５次后，种植于水琼脂培养基中，２７℃下恒温培养，表面消毒的最后一次冲洗用无菌水作为空白对照；　　　　（３）植物内生菌的分离纯化：将步骤（２）长出的内生菌，挑取不同形态的菌落，真菌至ＰＤＡ培养基，细菌至牛肉浸膏固体培养基中，划线培养至纯后，保存于相应的试管斜面中备用；　　　　（４）内生真菌发酵：将ＰＤＡ液体培养基分装在三角瓶中，用接种环挑取少许步骤（３）纯化的内生真菌菌丝于培养瓶中，置２７℃摇床，１５０ｒ／ｍｉｎ，振荡培养６－７天，发酵液经４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０－１５ｍｉｎ，取上清液；　　　　（５）内生细菌发酵：将牛肉浸膏液体培养基分装在三角瓶中，用接种环挑取少许步骤（３）纯化的内生细菌菌落于培养瓶中，置３７℃摇床，１５０ｒ／ｍｉｎ，振荡培养２－３天，发酵液经４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０－１５ｍｉｎ，取上清液；　　　　（６）发酵液的处理：向步骤（４）、（５）的上清液中加入９５％的乙醇，混合后使乙醇浓度为７５％，静置过夜，处理液４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０－１５ｍｉｎ，取上清液，４０℃减压蒸馏，真空干燥后保存于４℃冰箱备用；　　　　（７）菌体的处理：将步骤（４）、（５）的菌体置于圆底烧瓶用等量的丙酮或乙酸乙酯水浴回流提取２ｈ，浸提两次，４０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，６０℃减压蒸馏，浓缩干燥后保存于４℃冰箱备用；　　　　（８）有效抗菌菌株筛选：称取步骤（６）、（７）粉末，加入一定无菌水，使药液浓度为１０ｍｇ／ｍｌ，采用改进Ｋ－Ｂ纸片法，通过测量菌圈大小，判断抑制效果；　　　　（９）有效抗结核菌株筛选：将１０ｍｇ／ｍｌ药液与一定改良罗氏培养基混合成斜面后，接种浓度为１０３ｍｇ／ｍｌ的人型结核分枝杆菌，接种量为０．１ｍｌ，３７℃培养，观察菌落出现情况；　　　　（１０）菌种的保存：将步骤（７）筛选出的高抑制效率内生菌菌株接种于２５％无菌甘油中，－８０℃保存，备用。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王伯初，邓墨渊，杜慧娟，魏有章，唐玉斌，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]