一种抑制非洲菊未受精胚珠组织培养褐变的方法技术

本发明专利技术提供一种抑制非洲菊未受精胚珠组织培养褐变的方法。该方法通过在适宜的培养条件下，通过添加种类和浓度不同褐变抑制剂来抑制非洲菊未受精胚珠在组织培养过程中的褐变，采用这种抑制外植体褐变的方法后，可以有效的抑制非洲菊未受精胚珠在组织培养过程中的褐变，为其褐变对外植体的影响降到最低，为提高非洲菊未受精胚珠愈伤组织的诱导率和幼芽的分化奠定了基础，也保证了其组织培养的成功，具有较大的应用前景。

A method of inhibiting Gerbera unfertilized ovules browning in tissue culture

The present invention provides a method for inhibiting Gerbera unfertilized ovules browning in tissue culture. By this method under suitable culture conditions, by adding different kinds and concentrations of inhibitors to inhibit the browning of Gerbera unfertilized ovules in tissue culture browning, methods of inhibiting browning of explants using this, can effectively inhibit the gerbera unfertilized ovules in tissue culture browning, the browning of explants to minimize the impact, and lays a foundation for improving Gerbera ovule callus induction rate of unfertilized and bud differentiation, also ensure the success of tissue culture, it has great application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种抑制非洲菊未受精胚珠组织培养褐变的方法
本专利技术属于组织培养
，更具体地，涉及一种抑制非洲菊未受精胚珠组织培养褐变的方法。
技术介绍
非洲菊（Gerberajamesonii）是菊科大丁草属多年生常绿宿根草本花卉，又名扶郎花，为世界五大切花之一。非洲菊花型奇特、色彩艳丽、花枝挺拔，有单瓣、半重瓣和重瓣的栽培品种，是艺术插花、制作花束、花篮的理想材料。褐变现象在组织培养中普遍存在，这种现象与污染和玻璃化现象并称为植物组织培养的三大难题，褐变能否得到有效控制，是植物组织培养能否成功的关键所在。褐变是指外植体在培养过程中，由于多酚氧化酶的催化作用，将酚类物质氧化为褐色醌类物质，致使培养基和培养物变褐的现象。影响褐化的因素较多，外植体的取材、植物生长调节剂、培养基、添加剂、培养条件及培养方式都会影响愈伤组织的褐化程度。非洲菊所含酚类物质较多，在未受精胚珠培养过程中褐变现象严重，能否控制外植体褐变是其能否诱导出芽的关键。目前尚未有抑制非洲菊未受精胚珠组织培养褐变的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种抑制非洲菊未受精胚珠组织培养褐变的方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种抑制非洲菊未受精胚珠组织培养褐变的方法，包括如下步骤：S1.选择外轮舌状花全部展开，中心盘花开放前一天的花蕾，剪切花梗至10～12cm，插入装有水的瓶中，4℃低温处理3～5天；将低温处理后的花蕾进行消毒处理，再将经消毒处理的花蕾在解剖镜下剥取外轮舌状花的胚珠作为外植体；S2.将S1的胚珠接入下述培养基：MS中的大量元素和有机物+Heller中的微量元素+1/2铁盐+0.2mg/L6-苄基嘌呤+0.1mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+7mg/L琼脂，pH5.8～6.0；再加入500～1500mg/LPVP，25℃±2℃黑暗培养7天，然后在光照时间为10h/d～12h/d，温度为25℃±2℃的条件下，同步进行愈伤组织诱导和幼芽分化。优选地，S1所述消毒处理为先减掉花梗，将花蕾置于洗涤液中洗涤并浸泡20min，再用流水冲洗1h；再在超净环境下，用体积分数为75%的酒精浸泡灭菌1min，0.1%的氯化汞浸没花蕾8min，2%的次氯酸钠浸泡8min，以上处理后用无菌水冲洗5～6次。优选地，每100mL2%次氯酸钠中滴加2滴吐温-20。优选地，S2所述光照的强度为1500～2000lx。优选地，S2所述PVP为1500mg/L。本专利技术研究发现，通过适当时间的暗培养，采用最佳的褐变抑制剂种类和浓度，能够在很大程度上减轻外植体的褐变，以1500mg/L的PVP先进行7天的全黑暗培养，再转到光照强度1500lx～2000lx，光照时间为10h/d～12h/d的条件下培养的处理综合效果最好。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的是一种抑制非洲菊未受精胚珠组织培养褐变的方法，它是通过在适宜的培养条件下，通过添加种类和浓度不同褐变抑制剂来抑制非洲菊未受精胚珠在组织培养过程中的褐变，采用这种抑制外植体褐变的方法后，可以有效的抑制非洲菊未受精胚珠在组织培养过程中的褐变，为其褐变对外植体的影响降到最低，为提高非洲菊未受精胚珠愈伤组织的诱导率和幼芽的分化奠定了基础，也保证了其组织培养的成功。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1一种抑制非洲菊未受精胚珠组织培养褐变的方法，包括如下步骤：1、材料的选取：选择外轮舌状花全部展开，中心盘花开放前一天的花蕾；2、低温预处理：剪切步骤1所述的花蕾的花梗，留花梗长10～12cm，插入装有自来水的瓶中，放入4℃的冰箱中低温处理3～5天。3、材料消毒：（1）先减掉花梗，然后置于洗涤液中洗涤并浸泡20min，再用流水冲洗1h；（2）超净环境下，用体积分数为75%的酒精浸泡灭菌1min，0.1%的氯化汞浸没花蕾8min，2%的次氯酸钠（每100mL2%次氯酸钠中滴加2滴吐温20）浸泡8min，以上处理后用无菌水冲洗5～6次；4、外植体的获取：将消毒后的花蕾去除花托和中心盘花，只留取外轮舌状花，用解剖针剥取其完整胚珠作为外植体；5、将胚珠接入下述培养基：基础诱导培养基：MS当中的大量元素和有机物Heller中的微量元素1/2铁盐6-苄基嘌呤0.2mg/L萘乙酸0.1mg/L蔗糖30000mg/L琼脂7000mg/pH5.8～6.06、以上述培养基为基础培养基，在基础培养基上添加浓度为500mg/L的PVP；7、在温度为25℃±2℃，黑暗培养7天；8、再转换在光照强度1500lx～2000lx光照时间为10h/d~12h/d，温度为25℃±2℃的条件下，同步进行愈伤组织诱导和幼芽分化。实施例2本实施例除以下操作不同外，其余操作与实施例1相同，不在赘述；步骤6：在基础培养基上添加浓度为1000mg/L的PVP。实施例3本实施例除以下操作不同外，其余操作与实施例1相同，不在赘述。步骤6：在基础培养基上添加浓度为1500mg/L的PVP。表1不同浓度的PVP对外植体褐变的影响浓度（mg/L）接种数/个褐变率/%（14d）实施例15005080实施例210005072实施例315005054PVP是酚类物质的一种专项吸附剂，可以防止植物自身的酚类物质分泌和变褐老化，外植体的长势较好；本专利技术发现，当非洲菊未受精胚珠组织培养时，以1500mg/L的PVP抑制褐变的效果最好，同时对提高胚珠的膨大率也有很好的效果。对比例1本实施例除以下操作不同外，其余操作与实施例3相同，不在赘述；步骤7：不进行7天的黑暗培养，直接将接种好的胚珠置于光照强度1500lx~2000lx光照时间为10h/d~12h/d，温度为25℃±2℃的条件下，同步进行愈伤组织诱导和幼芽分化。表2黑暗处理对外植体褐变和膨大的影响黑暗处理接种数/个褐变率/%（14d）有5056无5070接种后，进行7天的全黑暗处理，再转换在光照强度1500lx～2000lx，光照时间为10h/d～12h/d，温度为25℃±2℃的条件下，对非洲菊为授精胚珠组织培养的褐变有很好的抑制作用。褐变是植物组织培养中的一个难题，是很多植物组培能否成功的关键因素。影响褐化的因素较多，外植体的取材、植物生长调节剂、培养基、添加剂、培养条件及培养方式都会影响愈伤组织的褐化程度。本实验结果表明，通过适当时间的暗培养，采用最佳的褐变抑制剂种类和浓度，能够在很大程度上减轻外植体的褐变，以1500mg/L的PVP先进行7天的全黑暗培养，再转到光照强度1500lx～2000lx，光照时间为10h/d～12h/d的条件下培养的处理综合效果最好。本专利技术并不限于上述实例，在本专利技术权利要求书所限定的范围内，本领域技术人员对本专利技术的技术方案所做的任何改动均受本专利保护。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制非洲菊未受精胚珠组织培养褐变的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.选择外轮舌状花全部展开，中心盘花开放前一天的花蕾，剪切花梗至10～12cm，插入装有水的瓶中，4℃低温处理3～5天；将低温处理后的花蕾进行消毒处理，再将经消毒处理的花蕾在解剖镜下剥取外轮舌状花的胚珠作为外植体；S2.将S1的胚珠接入下述培养基：MS中的大量元素和有机物+Heller中的微量元素+1/2铁盐+0.2 mg/L 6‑苄基嘌呤+0.1 mg/L萘乙酸+30 g/L蔗糖+7 mg/L琼脂，pH 5.8～6.0；再加入500～1500 mg/L PVP，25℃±2℃黑暗培养7天，然后在光照时间为10h/d～12h/d，温度为25℃±2℃的条件下，同步进行愈伤组织诱导和幼芽分化。

【技术特征摘要】
1.一种抑制非洲菊未受精胚珠组织培养褐变的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.选择外轮舌状花全部展开，中心盘花开放前一天的花蕾，剪切花梗至10～12cm，插入装有水的瓶中，4℃低温处理3～5天；将低温处理后的花蕾进行消毒处理，再将经消毒处理的花蕾在解剖镜下剥取外轮舌状花的胚珠作为外植体；S2.将S1的胚珠接入下述培养基：MS中的大量元素和有机物+Heller中的微量元素+1/2铁盐+0.2mg/L6-苄基嘌呤+0.1mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+7mg/L琼脂，pH5.8～6.0；再加入500～1500mg/LPVP，25℃±2℃黑暗培养7天，然后在光照时间为10h/d～12h/d，温度...

【专利技术属性】
技术研发人员：范燕萍，罗燕羽，曹秋香，余让才，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44