一种黄瓜霜霉病抗性主效ＱＴＬ连锁的分子标记方法，是通过以下步骤获得： ａ）得到黄瓜霜霉病抗病品种Ｓ９４（♀）和黄瓜霜霉病感病品种Ｓ０６（♂）和杂交，得到杂种Ｆ↓［１］； ｂ）由杂种Ｆ↓［１］自花授粉获得Ｆ↓［２］子代，通过子代单粒传方法获得Ｆ↓［７］代的重组自交系； ｃ）对重组自交系每个株系进行分子标记分析，并对重组自交系每个株系的基因型进行描述；具体方法：分离重组自交系每个株系的基因组ＤＮＡ，采用相关序列扩增多态性、微卫星、序列特异性扩增区和序列标签位点分子标记引物进行ＰＣＲ扩增，扩增产物在１．５％琼脂糖凝胶和６ｇ／１００ｍｌ聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得分子标记资料； ｄ）基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，用获得的分子标记资料构建遗传连锁图； ｅ）测定重组自交系每个株系的霜霉病抗性； ｆ）将重组自交系每个家系的霜霉病抗性与黄瓜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和ＱＴＬ分析，ＱＴＬ分析采用ＷｉｎＣａｒｔＱＴＬ２．１进行，先进行测验，Ｐ＜０．００５表明该标记与霜霉病抗性连锁，可能存在ＱＴＬ，然后对可能存在ＱＴＬ的区间进行复合区间作图，以２．５为ＬＯＤ阈值，大于２．５说明存在一个ＱＴＬ位点，从而确定与抗源Ｓ９４霜霉病抗性主效ＱＴＬ的分子标记Ｅ２３ｍ１８ｄ、ＣＭＢＲ４０和ＣＭＢＲ９７。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种分子生物
的标记方法，尤其是一种黄瓜霜霉 病抗性主效QTL连锁的分子标记方法和应用方法。技术背景霜霉病(downy mildew)是世界各地黄瓜(Cucumis sativus L.)产区的 重要病害之一，在我国，霜霉病与霜霉病、枯萎病并列为黄瓜三大病害。黄瓜霜 霉病是由古巴假霜霉病菌引起，该病原菌属鞭毛菌亚门，霜霉菌目，假霜霉属。其主要危害黄瓜 叶片，在苗期、成株期均可发病。在适宜的条件下，它的病情发展很快，几天时 间便会蔓延到全田，造成叶片发黄、枯死，减产30%-50%。随着分子标记辅助育种技术的迅速发展，为有效的解决这个问题提出了新 的方法。通过构建重要抗源的遗传图谱和数量性状位点(Quantitative Tratit Loci，QTL)分析，可以找到与黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁(或共分离)的分子 标记。Johan D， TRENDS in Plant Science (植物科学趋势)，2003， Vol. 8 No. 7; Meglic V， Theor Appl Genet (应用遗传理论)，1996， 92: 865-872，该文报 道使用与某一特定抗源抗霜霉病主效QTL连锁的分子标记，可以对该特定抗源的 后代及其衍生品种(系)在苗期进行早代筛选，淘汰不抗病的植株，节约常规育 种的生产成本，提高育种和选择效率。S94是中国华北陆地型黄瓜品系，很多黄 瓜育种家已经把它作为抗霜霉病亲本，其霜霉病抗性主效QTL相连锁的分子标记。使用杀菌剂和推广抗病品种是抵抗霜霉病危害的主要方法。长期使用杀菌 剂会危害环境安全,且易引起病菌小种变异产生拮抗作用。种植抗病品种是安全、 环保和高效的控制策略。大量前人工作(吕淑珍，天津农林科技，1990， 2:22-24; vanVliet G JA. ， Pierce L K， Hortscience (园艺科学),1990， 25: 605-615; Meglic V， Theor Appl Genet (应用遗传理论)，1996, 92: 865-872)已表明， 黄瓜霜霉病的抗性遗传机理复杂。常规育种实践中，对于抗霜霉病材料的选择是十分困难的 一方面选育周期长；另一方面霜霉病的发生受到很多因素的综合影 响，例如温度、湿度和病菌小种等，鉴定抗性材料的过程不容易控制。这些都 导致黄瓜霜霉病育种进展缓慢的重要原因。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是针对现有技术的现状，提供一种黄瓜霜霉病抗性主效 QTL连锁的分子标记方法。使其在黄瓜抗霜霉病育种中应用，用以界定与S94的 霜霉病抗性主效QTL相连锁的分子标记，通过检测这些分子标记可以预测黄瓜植株的霜霉病抗性，加快抗霜霉病黄瓜的选择进度，在生产上用于检测黄瓜品种的 霜霉病抗性水平。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术所涉及的黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记方法，包括以下步骤a) 得到黄瓜霜霉病抗病品种S94(早)和黄瓜霜霉病感病品种S06("和杂 交，得到杂种F"b) 由杂种R自花授粉获得F2子代，通过子代单粒传(SSD)方法获得&代的 重组自交系；c) 对重组自交系每个株系进行分子标记分析，并对重组自交系每个株系的 基因型进行描述；具体方法分离重组自交系每个株系的基因组DNA，采用相关 序列扩增多态性(SRAP)、微卫星(SSR)、序列特异性扩增区(SCAR)和序列标 签位点(STS)分子标记引物进行PCR扩增，扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶(SCAR、 STS)和6g/100ml聚丙烯酰胺凝胶(SRAP、 SSR)上电泳分离后，获得分子标记 资料；d) 基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，用获得的分子标记资料构建 遗传连锁图；e) 测定重组自交系每个株系的霜霉病抗性；f) 将重组自交系每个家系的霜霉病抗性与黄瓜遗传连锁图中的分子标记进 行连锁和QTL分析，QTL分析采用WinCart QTL2. 1进行，先进行 Kruskal-Wallis(K-W)测验，P < 0. 005表明该标记与霜霉病抗性连锁，可能存在 QTL，然后对可能存在QTL的区间进行复合区间作图，以2.5为L0D阈值，大于2. 5说明存在一个QTL位点，从而确定与抗源S94霜霉病抗性主效QTL的分子标 记E23ml8d、 CMBR40和CMBR97。所述的黄瓜抗霜霉病品系S94是从中国北方长春密刺的后代变异株系从选择。用黄瓜叶片分离的丽A， 采用引物GACTGCGTACCAATTCTA 和 GATGAGTCTAGAACGGCT; CgACAATCACgggAgAgTTT和TTgTTgCATCAAACTAACACAATC ; CgACAATCACgggAgAgTTT和CATATTAgACCCATATTTgTTgCAT;进行PCR扩增，扩增产 在在1.5%琼脂糖凝胶和6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，分别获得分子标记 E23ml8d、 CMBR40和CMBR97的扩增产物；大小分别为350bp、 425bp和510bp 。 所述的琼脂糖凝胶，是指100ml TAE溶液中含有1.5克琼脂糖。 所述的聚丙烯酰胺凝胶，是指100ml聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5. 7克丙 烯酰胺和0. 3克甲叉双丙烯酰胺。本专利技术所涉及的应用黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记的方法，将 分子标记E23ml8d、 CMBR40和CMBR97作为辅助选择标记在S94及其衍生品系为 抗源的黄瓜霜霉病育种中，通过其基因型来判断其衍生品种或品系是否具有霜霉 病抗性，包括以下步骤a) 将通过S94及其衍生品系为父本或母本与其他黄瓜杂交并繁衍至R代以上；b) 分离单个黄瓜植株的基因组DNA，检测每个黄瓜植株是否存在与霜霉病 主效QTL相连锁的分子标记；如有2个以上分子标记同时出现，则预测该黄瓜的 霜霉病的达到抗性的水平。所述的S94及其衍生品系，是指以S94为亲本，通过常规杂交、或采用组 织培养、或采用组织培养、或采用花药培养、或用别的物理或化学方法杂交诱导 单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体或采用遗传转化方法获得的黄瓜品种或品系。本专利技术黄瓜抗霜霉病主效QTL分子标记及其黄瓜抗霜霉病育种中的应用，优点在于克服常规育种中黄瓜霜霉病抗性鉴定易受环境影响，育种周期长、效率低的不足，发挥分子标记辅助选择的特长，发展一种高效、快速的育种新技术。例如利用常规抗霜霉病育种方法选育一个新品种或新品系，往往要6-8年，甚至更长时间，同时每代都需要对群体进行抗性鉴定，工作量很大。此外，抗霜霉病 鉴定又往往受环境条件的影响，而分子标记辅助选择不受环境条件的影响，在低 世代就可以对霜霉病抗性进行选择，将大大减少育种家的工作量，提高选择的准 确性和育种效率。本专利技术涉及的"黄瓜霜霉病抗病病菌"、"黄瓜霜霉病感病病菌"的孢子 悬液由上海交通大学农业与生物学院潘俊松博士提供，相关文献发表在期刊《自然科学进展》，2008年第5期，11-17页。 附图说明图l S9霜霉病抗性QTL连锁群定位分析位置图。其中包含QTL的连锁群区段被显示，左侧为标记之间的距离(cM);右侧 为标记名称。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的实施例作详细说明本实施例在以本专利技术技术方案 为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄瓜霜霉病抗性主效ＱＴＬ连锁的分子标记方法，是通过以下步骤获得：ａ）得到黄瓜霜霉病抗病品种Ｓ９４（♀）和黄瓜霜霉病感病品种Ｓ０６（♂）和杂交，得到杂种Ｆ↓［１］；ｂ）由杂种Ｆ↓［１］自花授粉获得Ｆ↓［２］子代，通过子代单粒传方法获得Ｆ↓［７］代的重组自交系；ｃ）对重组自交系每个株系进行分子标记分析，并对重组自交系每个株系的基因型进行描述；具体方法：分离重组自交系每个株系的基因组ＤＮＡ，采用相关序列扩增多态性、微卫星、序列特异性扩增区和序列标签位点分子标记引物进行ＰＣＲ扩增，扩增产物在１．５％琼脂糖凝胶和６ｇ／１００ｍｌ聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得分子标记资料；ｄ）基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，用获得的分子标记资料构建遗传连锁图；ｅ）测定重组自交系每个株系的霜霉病抗性；ｆ）将重组自交系每个家系的霜霉病抗性与黄瓜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和ＱＴＬ分析，ＱＴＬ分析采用ＷｉｎＣａｒｔＱＴＬ２．１进行，先进行测验，Ｐ＜０．００５表明该标记与霜霉病抗性连锁，可能存在ＱＴＬ，然后对可能存在ＱＴＬ的区间进行复合区间作图，以２．５为ＬＯＤ阈值，大于２．５说明存在一个ＱＴＬ位点，从而确定与抗源Ｓ９４霜霉病抗性主效ＱＴＬ的分子标记Ｅ２３ｍ１８ｄ、ＣＭＢＲ４０和ＣＭＢＲ９７。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡润，刘龙洲，白智龙，潘俊松，何欢乐，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31
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