本发明专利技术涉及一种核酸检测方法，特别是公开了一种线粒体全部碱基序列分型及其测定方法，具体而言是线粒体测序用２６对ＰＣＲ引物及基于该引物的分型方法。本发明专利技术选用的２６对ＰＣＲ引物覆盖了线粒体基因组全长，其中引物１５－１、１５－２、１５－３、２４－１、２４－２针对中国人群重新设计，对中国人群的分型具有针对性；引物２４－１对应的扩增片段最小，为４２０ｂｐ；引物２２对应的扩增片段最大，为１１６２ｂｐ；所有ＰＣＲ片段大小适中，均适宜ＰＣＲ扩增。本发明专利技术的２６对ＰＣＲ引物已在申请人的实验室应用于中华民族群体遗传资料调查，已向ＧＥＮＥＢＡＮＫ数据库提交了中国人群线粒体全序列资料。结果表明，本发明专利技术完全可以应用在法医学、人类学、遗传学和疾病等领域的个体识别、亲子鉴定以及基因诊断等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种核酸检测方法，特别是一种线粒体全部碱基序列分型及其 测定方法，，具体而言是线粒体测序用26对PCR引物及基于该引物的分型方法。
技术介绍
线粒体(mtDNA)碱基分型，目前最常用的是应用多聚酶链式反应(PCR) 扩增出需要的DNA片断，将扩增产物进行直接测序，并根据片段的碱基序列与 线粒体标准序列进行比对得到结果。对于PCR产物的直接测序可用PAGE结 合银染，以及荧光标记序列仪自动分析系统。对线粒体的研究在国内还集中于 线粒体特定高变区，目前国际上线粒体已完成了全部碱基序列测定并予以公布， 但在生物医学研究及法医学应用实践中存在以下问题(1) 已有的线粒体碱基序列测定方法没有统一的方案，需要人为选择。(2) 这些线粒体碱基序列都是基于中国群体以外的群体(主要是白人群体) 测定而获得的资料，其中有些基因位点，在中国群体的基因频率分布较差，并 不能反映出中国群体的线粒体序列特点。(3) 国外公布的线粒体测定方法仍在改进，不同实验室之间无法达到结果 的标准化。上述缺点限制了线粒体遗传标记在国内的应用，不利于进一步在基层推广。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供适合中国群体的线粒体测序用PCR引 物，以及基于所述线粒体测序用PCR引物的分型方法，该方法方便进行中国群体遗传学及法医学应用研究。线粒体是人类第二套基因组，mtDNA具有严格的母系遗传特点，线粒体DNA的突变率高于核DNA的5 10倍，因此，线粒体DNA与核DNA序列相比，可 以在较短进化时期内积累更多的核苷酸变化的信息，在追踪民族起源方面有着 其它遗传标记无法比拟的优势，为现代人类的起源、人类迁移规律和进化提供 了大量的证据。另外，线粒体DNA全序列仅一万多个碱基，其多态性集中体现 在D-环区，仅1100多个碱基，DNA序列测定较为简便，成为法医检案中一种新 的检测手段。在法医学个体识别中，通过mtDNA序列分析可实现一定程度的认 定作用，尤其在特定人群的个体识别中(空难、遗骸的鉴定)发挥重要作用。本专利技术提供了一种线粒体测序用26对PCR引物，选用的26对PCR引物覆 盖了线粒体基因组全长(表l)，其中引物15-1、 15-2、 15-3、 24-1、 24-2针对中 国人群重新设计，对中国人群的分型具有针对性；引物24-1对应的扩增片段最 小，为420bp;引物22对应的扩增片段最大，为1162bp;所有PCR片段大小适 中，均适宜PCR扩增。表l PCR引物序列<table>table see original document page 6</column></row><table><table>table see original document page 7</column></row><table>本专利技术所选26对PCR引物已在西安交通大学卫生部法医学重点实验室应用 于中华民族群体遗传资料调查，经数据处理证明，应用所提供的26对PCR引物扩 增目的片段，通过直接测序的方法可以得到中国人群线粒体全碱基序列资料。 另外在新设计引物区域，使用国外己有的线粒体序列测定方法无法获得中国人 群稳定的实验结果，显示出中国人群存在独特的线粒体序列特点，根据本专利技术所述线粒体分型方法得到的结果，实验室已向GENEBANK数据库提交了中国人 群线粒体全序列资料共6条(检索号DQ519035、 DQ462234、 DQ462233、 DQ462232、 DQ418488、 DQ437577)。结果表明，本专利技术所提供的线粒体测序用 PCR引物和基于所述线粒体测序用PCR引物的分型方法完全可以应用在法医学、 人类学、遗传学和疾病等领域的个体识别、亲子鉴定以及基因诊断等方面。本专利技术的另一个技术方案是:基于所述线粒体测序用26对PCR引物的分型 方法，其特征在于，包括以下步骤选用所述线粒体测序用26对PCR引物，将上下游引物稀释成10(VMOL/L， 作为母液，取出l(V 1稀释到5pMOL/L，作为工作液；PCR扩增体系的体积为 20^L，含lx反应缓冲液，1.5mMOL/LMgcl2， 0.5UTaq酶，0.25nMOL/L引物， 200^iMOL/L dNTP， DNA20 200ng;引物的PCR扩增基础参数为95'C变性 30s，根据PCR引物不同确定退火温度进行30s， 72。C延伸60s，共计35个循环；纯化PCR扩增产物；测序反应体系为1(^1，反应混合物中含纯化后的PCR扩增产物10ng、Big-Dye Terminator Ready Reaction mix(ver.3.1，美国应用生物系统公司)0.7|il，测序引物0,3pM;测序PCR条件为96'C变性10秒，50'C退火5秒，60'C延伸4分钟，共循环25次；纯化测序反应产物；纯化后的测序反应产物使用直接测序法检测；将26对PCR引物测序获得的碱基序列拼接得到样本线粒体全碱基序列，将样本碱基序列与线粒体标准序列比对即可获得样本碱基序列差异，从而完成线粒体分型。本专利技术带来的技术优点是，利用给定的引物直接扩增结合直接测序的方法 进行分型，所需仪器和设备及操作均可达到标准化，且方案成熟，适合应用于 中国人群。本专利技术可以填补国内没有实用化的线粒体全序列检测技术和方案的 空白，并在中国多个民族中获得满意的结果，利用这种技术制备的线粒体全序列分型试剂盒，可进行商业化生产并推广为国内各个实验室使用。该技术克服 了需要人为选择线粒体碱基序列测定方法，对实验人员技术和经验要求较高的 缺陷，可以应用于亲子鉴定、个体识别、线粒体遗传致病基因定位、易感基因 的检出、发病的分子遗传机理研究、药物的设计及使用等方面，具有广泛的应 用前景。附图说明图1为线粒体测序用26对PCR引物对应位点示意图。具体实施方式 本专利技术线粒体测序用PCR引物见表1 。本专利技术基于所述线粒体测序用PCR引物的分型方法，利用覆盖线粒体基因 组全长的26对PCR引物扩增目的片段，直接测序检观!l，并进行分型。1. 设计引物序列PCR引物序列设计参照Genebank (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)发布的线粒体 标准序列，上下游引物序列见表l。线粒体DNA序列为环形，引物设计策略见图 1。选用所述线粒体测序用26对PCR引物，将上下游引物稀释成100nMOL/L， 作为母液，取出10pl稀释至U5^MOL/L，作为工作液。2. PCR扩增PCR反应体系总体积20p 1 ，含lx反应缓冲液，1.5mMol/LMgCl2， 0.5U丁aq 酶，0.25liMol/L引物，200^Mol/L dNTP， DNA20 200ng。使用PE9600扩增仪， PE9700扩增仪(美国应用生物系统公司)，其它类型扩增仪也可以得到较好的结 果。目前各种方法提取的DNA模板，均适合线粒体碱基序列的扩增。本实验PCR反应所用试剂均为通用试剂，PCR产物的检测采用常规的方法。 PCR扩增参数见表2。表2 PCR扩增条件引物名称变性温度/时间退火温度/时间延伸温度/时间循环次数195。C30s54。C30s72。本文档来自技高网...
【技术保护点】
线粒体测序用２６对ＰＣＲ引物，包括 引物１ １Ｆ ＣＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＡＣＡＣＴＧ ３′结合位点６１１ １Ｒ ＴＧＣＴＡＡＡＴＣＣＡＣＣＴＴＣＧＡＣＣ ３′结合位点１４１１ 引物２ ２Ｆ ＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴ ３′结合位点１２４５ ２Ｒ ＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＡＴＣＡＣＣＡ ３′结合位点２００７ 引物３ ３Ｆ ＧＧＡＣＴＡＡＣＣＣＣＴＡＴＡＣＣＴＴＣＴＧＣ ３′结合位点１８５４ ３Ｒ ＧＧＣＡＧＧＴＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴ ３′结合位点２６６９ 引物４ ４Ｆ ＡＡＡＴＣＴＴＡＣＣＣＣＧＣＣＴＧＴＴＴ ３′结合位点２４９９ ４Ｒ ＡＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＡＧ ３′结合位点３３４６ 引物５ ５Ｆ ＴＡＣＴＴＣＡＣＡＡＡＧＣＧＣＣＴＴＣＣ ３′结合位点３１６９ ５Ｒ ＡＴＧＡＡＧＡＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＧＧＧ ３′结合位点３９６１ 引物６ ６Ｆ ＴＧＧＣＴＣＣＴＴＴＡＡＣＣＴＣＴＣＣＡ ３′结合位点３７９６ ６Ｒ ＡＡＧＧＡＴＴＡＴＧＧＡＴＧＣＧＧＴＴＧ ３′结合位点４８５４ 引物７ ７Ｆ ＡＣＴＡＡＴＴＡＡＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣ ３′结合位点４４８５ ７Ｒ ＣＣＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧ ３′结合位点５４２０ 引物８ ８Ｆ ＣＴＡＡＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＧＣＣＣ ３′结合位点５２５５ ８Ｒ ＡＣＣＴＡＧＡＡＧＧＴＴＧＣＣＴＧＧＣＴ ３′结合位点６０３１ 引物９ ９Ｆ ＧＡＧＧＣＣＴＡＡＣＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴ ３′结合位点５８５５ ９Ｒ ＡＴＴＣＣＧＡＡＧＣＣＴＧＧＴＡＧＧＡＴ ３′结合位点６６４２ 引物１０ １０Ｆ ＣＴＣＴＴＣＧＴＣＴＧＡＴＣＣＧＴＣＣＴ ３′结合位点６４６９ １０Ｒ ＡＧＣＧＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＣＡ ３′结合位点７３１５ 引物１１ １１Ｆ ＡＣＧＣＣＡＡＡＡＴＣＣＡＴＴＴＣＡＣＴ ３′结合位点７１４８ １１Ｒ ＣＧＧＧＡＡＴＴＧＣＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴ ３′结合位点８０９５ 引物１２ １２Ｆ ＡＣＧＡＧＴＡＣＡＣＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣ ３′结合位点７９３７ １２Ｒ ＴＧＧＧＴＧＧＴＴ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李生斌，刘清波，赖江华，张洪波，杨丽，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]
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