一种干细胞体外衍生化肝细胞模型的应用制造技术

本发明专利技术提供一种小鼠胚胎干细胞体外衍生化肝细胞模型的应用，主要用于以过氧化物酶体增殖激活受体为靶点的促细胞分化剂筛选。也可利用干细胞衍生化肝细胞模型阐明肝脏发育能量代谢相关的ＰＰＡＲｓ家族表达谱和功能，揭示胚胎肝脏发育的生命现象本质。也可利用干细胞衍生化肝细胞模型，构建以ＰＰＡＲｓ家族为靶点的高效率药效筛选模型，进行调节肝脏能量供应药效初步筛选与评价，发现新一类促进干细胞分化为肝细胞的能量代谢诱导剂。本发明专利技术开拓了干细胞衍生化肝细胞模型的一种新用途，即能作为肝脏发育能量代谢研究的替代模型，明确肝脏线粒体能量系统发育相关的ＰＰＡＲｓ家族表达特征，可用于以ＰＰＡＲｓ为靶点的促肝细胞能量代谢分化剂筛选。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属发育生物学和药理学领域，涉及一种模型的用途，具体涉及干细 胞体外衍生化肝细胞模型在肝脏发育能量代谢研究中的应用，可用于以过氧化 物酶体增殖激活受体为靶点的促细胞分化剂筛选。
技术介绍
小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)体外定向分化为肝细胞体 系能模拟体内肝细胞形成和发育，富含大量肝脏发育依赖性生物信息。该系统 中肝细胞多种关键基因表达高于原代成熟肝细胞；具有白蛋白合成和氨降解功 能；代谢功能也比原代肝细胞强，维持时间长，因此无论结构还是功能均高度 模拟整体环境，该模型可用于肝脏发育学和组织工程研究，在药学研究领域非 常适用于药物调控各种基因、蛋白表达谱和与药物代谢作用的研究。过氧〈七物酶体增生物、激、活受体(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)是由独立基因编码的一类孤儿核受体，属于II型核受体超家族成员， 可调节众多靶基因的转录过程，参与糖类、脂类代谢以及细胞增殖分化、炎症 等多种病理生理过程。在低等脊椎动物和哺乳动物中存在3种亚型PPAR-a、 PPAR-j3 (又称PPAR-S) 、 PPAR-y。这三个成员在表达模式，组织分布以及对 应的配体上都存在差异。PPAR-a主要在棕色脂肪组织、肝脏、肾脏、十二指 肠、心脏、骨骼肌和血管内皮细胞中表达，与控制脂蛋白代谢、脂肪酸氧化、 细胞摄入脂肪酸有关。PPAR-P组织分布广泛，与脂质代谢和皮肤的平衡态有 关，还与动物的生殖发育，胚胎着床与发育等有关。PPAR-y在棕色和白色脂肪 组织中高度表达，与脂质代谢、血管炎症和促成动脉粥样硬化等有关，并在脂 肪分化和脂肪蓄积方面发挥着重要作用。上述大量研究表明调节脂质代谢和储 存的大量相关基因都是受PPARs家族调控，除此之外，PPARs对某些细胞分 化的调节也有一定作用，如心肌细胞，神经细胞，脂肪细胞以及一些肿瘤细胞。 但对PPAR家族在肝脏生理和分化发育过程中的表达模式和作用所知甚少。肝脏是能量需求旺盛的器官，肝细胞是线粒体数目丰富的一类细胞。随着 肝脏组织不断发育成熟，必然伴随着线粒体数目上调和能量需求增加，任何干 扰线粒体形成的因素将会影响肝脏细胞的最终分化。线粒体的形成包括氧化磷酸化酶系表达，TCA循环形成以及脂肪p氧化酶系表达，而调控线粒体形成相 关基因转录和蛋白表达的主要是几类核转录因子及其辅激活因子，其中包括 PPARs。 PPARs可以调节细胞的分化、增殖和生存。PPARs在肝脏脂质代谢功 能方面发挥重要调节作用，其功能改变与一些肝脏疾病的发生发展存在某种相 关性。小鼠ES细胞体外分化为肝细胞真实地重现了体内肝细胞分化过程，已 作为一个替代模型广泛用于各种研究，迄今未见干细胞衍生化肝细胞模型在肝 脏发育能量代谢研究中的应用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供小鼠胚胎干细胞衍生化肝细胞模型在肝脏发育 能量代谢研究中的应用，是在利用肝脏发育能量代谢相关的PPARs家族表达谱 和功能揭示胚胎肝脏发育的生命现象本质中应用。即是利用干细胞衍生化肝细 胞模型阐明肝脏发育能量代谢相关的PPARs家族表达谱和功能，用于揭示胚胎 肝脏发育的生命现象本质。所述应用是在筛选与评价调节肝脏能量供应的能量代谢诱导剂药物中的 应用。可在以过氧化物酶体增殖激活受体为耙点的促细胞分化剂筛选中应用， 是用于构建以PPARs家族为靶点的高效率药效筛选模型，进行调节肝脏能量供 应药效初步筛选与评价，发现新一类促进干细胞分化为肝细胞的能量代谢诱导 剂。本专利技术所述小鼠胚胎干细胞体外衍生肝细胞模型通过以下步骤构建采用 悬滴培养法，将ES细胞以600个细胞/30 ^滴的密度接种于培养皿盖子内表面 上，然后翻转盖子，使盖子上的小滴倒挂成悬滴，培养5天形成拟胚体 (embryoid body, EB)，再将EB转移到放有用明胶包被的24孔板内进行贴壁 培养，此时开始用倒置显微镜每天观察细胞，以捕捉肝细胞定向分化的形态变 化。同时采用免疫荧光法检测肝细胞特异性蛋白表达，以白蛋白特异性染色确 定ES细胞分化而来的是肝细胞。本专利技术在细胞层面上对干细胞衍生化肝细胞模型在肝脏发育能量代谢研 究中的应用做了论证，对其中蕴藏的大量生物学信息进行了初步探讨，具体有 以下优点1. 本专利技术开拓了干细胞衍生化肝细胞模型的一种新用途，即能作为肝脏发 育能量代谢研究的替代模型。2. 本专利技术明确了肝脏线粒体能量系统发育相关的PPARs家族表达特征, 该模型可用于以PPARs为靶点的促肝细胞能量代谢分化剂筛选。附图说明图1为ES细胞衍生化肝细胞形态观察。图2为JC-1染色检测ES细胞向肝细胞分化过程中线粒体膜电位变化。 图3为RT-PCR法检测ES细胞分化过程中PPAR家族基因的表达。 图4为ES细胞衍生化肝细胞白蛋白和PPAR-oc的表达。 具体实例方式本专利技术结合附图和实施例作进一步的说明。此外应理解，下面的优选具体 实施方案仅仅是举例说明，而非以任何方式限制本专利技术的范围。实施例l: ES细胞体外衍生化肝细胞模型通过以下步骤构建1. 悬滴培养将ES细胞用胰蛋白酶消化制成细胞密度为2xl(^个/ml的单细胞悬液，以 30 pl接种于直径为10-cm的培养皿的盖子内表面上，培养皿内加入10ml D-Hanks液，然后小心盖上带有许多小滴的盖子，使盖子上的小滴倒挂成悬滴 (每个悬滴约含600个细胞)，置培养箱中培养5d。分化培养液为高糖DMEM， 含0.1mmol.L"p-巯基乙醇，非必需氨基酸和20 %胎牛血清，不含LIF因子。2. 贴壁培养在显微镜下用吸管将悬滴培养形成的拟胚体(embryoidbody,EB)，转移到 放有用明胶包被的24孔板内，使其吸附贴壁后，每孔中缓慢加入lml分化培 养液，此时开始用倒置显微镜每天观察细胞，以捕捉肝细胞定向分化的形态变 化。将EB转移至24孔板内记为dO。3. 免疫荧光法检测肝细胞特异性蛋白表达样本用纯冷甲醇固定15 min， PBS清洗3遍，每次10 min。再用含10 % 胎牛血清PBS封闭30 min， PBS清洗3遍，每次5 min。然后加入一抗 Monoclonal rabbit anti-Albumin， l:50稀释，4。C孵育过夜。PBS洗3次，每次 10min，吸干多余的液体，再力卩入二抗Rodamin画Conjugated F(ab)2 fragment of Affinity Purified goat anti-Rabbit IgG， 1:200稀释，37。C孵育1.5 h。再用PBS 洗3次，每次lOmin，吸干多余的液体，无荧光甘油封片后用荧光显微镜观察， 拍照记录。以白蛋白特异性染色确定ES细胞分化而来的是肝细胞。参见图l， 其中(A)低倍镜下的肝细胞，xlOO; (B)高倍镜下的肝细胞，x400; (C)肝 细胞特异性白蛋白呈阳性表达，箭头所指是典型的双核肝细胞，x400。实施例2: ES细胞体外衍生化为肝细胞线粒体膜电位变化收集ES细胞，EB经消化成单个细胞，EB贴壁培养分化成肝细胞样本， 加入JC-1染料孵育15分钟，用PBS洗三次，在荧光倒置显微镜下观察。结果显示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小鼠胚胎干细胞体外衍生化肝细胞模型的应用，所述小鼠胚胎干细胞体外定向分化为肝细胞模型通过以下步骤构建：采用悬滴培养法，将小鼠胚胎干细胞以６００个细胞／３０μｌ滴的密度接种于培养皿盖子内表面上，然后翻转盖子，使盖子上的小滴倒挂成悬滴，培养５天形成拟胚体，再将拟胚体转移到放有用明胶包被的２４孔板内进行常规贴壁培养，用倒置显微镜每天观察细胞，以捕捉肝细胞定向分化的形态变化，同时采用免疫荧光法检测肝细胞特异性蛋白表达，以白蛋白特异性染色确定小鼠胚胎干细胞分化而来的是肝细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱丹雁，楼宜嘉，吴佳莹，严洁萍，沃燕波，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]