一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸性质的方法。该方法确定待测ＤＮＡ片段的一条单链上的包含变异位点的靶序列，制备对应于靶序列的碱基淬灭探针，探针的一端仅一端结合有荧光基团，制备与待测ＤＮＡ片段相对应的一对引物，然后进行聚合酶链式反应，再将探针杂交于扩增后的待测ＤＮＡ片段的含有变异位点的靶序列上，再测定融解温度，即可对待测ＤＮＡ片段的变异位点的单核苷酸是否具有单核苷酸多态性进行判断。本发明专利技术具有成本较低、操作方便、检测时间较短的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸性质的方法。
技术介绍
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)是指在基因组水平上由单个 核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性。基因调控区和编码区的SNPs比其它区位上的 SNPs更可能造成功能上的变化。分型这些双等位基因标志给鉴定致病基因、建立药物靶向 治疗以及个体化给药提供了很大的可能。因此，无论是学术界还是商业界对建立一种快速、 敏感而经济的检测SNP的方法都有浓厚的兴趣。许多经典的方法，如限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析和凝胶迁移率变动分析法等，因受繁琐的操作程序、突变位点以及靶序列构象 的限制而限制了应用范围。这些方法所需的检测时间长，并且需要有经验的技术员来分析 最终结果。近来，出现了许多新的快速分型SNP的技术。如基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理的单管快速SNP检测法、基于等位基 因特异性引物延伸并且利用绿色和红色荧光标记的单核苷酸基因分型法、利用淬灭基团延 伸(Quencherextension, QEXT)实时闭管检测SNP法、双联蝎型引物分析SNP技术、固相 支持SNP分型法、使用核酸外切酶III/核酸酶S 1/PNA体系直接正向检测SNP法、孪生探针法、 多态核酸探针偶联聚合物检测法以及利用全程TaqMan实时定量数据自动基因分型法等。然 而，以上所提及的技术需要昂贵的试剂，并且在中国，除了TaqMan探针及分子信标探针之 外，极少有公司修饰其它类型的探针(包括FRET探针)。上述方法中，如酶切法等时间较 长、标记范围也较小。还有采用分子信标探针进行SNP检测的方法采用人工合成的荧光标记寡核苷酸探针(寡核苷酸是一类只有30个以下碱基的短链核苷酸的总称，在寡核苷酸的端部连接荧光报 告基团或/和荧光淬灭基团则构成探针)，该探针的两端由5 7个与靶序无关的互补碱基组 成， 一端标记荧光报告基团，另一端标记淬灭基团。这样在游离状态下，荧光探针两端互 补折叠成茎环结构，寡核苷酸探针的荧光报告基团与淬灭基团在空间非常接近，此时荧光 报告基团经激发后发射出的荧光能量被淬灭基团吸收，不产生荧光信号，表现为荧光淬灭。而当探针与靶DNA杂交后，探针的茎环结构被破坏，淬灭基团离开荧光报告基团，经激发 后荧光报告基团所产生的荧光信号向外发出。因而可以根据所发射荧光的情况，判断是否 有碱基突变。但是，这种方法在进行探针的设计时，其标记的范围较小。 '中国专利申请200310119928.3公开了一种用荧光共振能量转移而进行SNP检测的方 法，该方法选择两种探针， 一种探针结合有荧光团供体，另一种探针结合有荧光团受体， 在激发光的照射下，荧光团供体受激向荧光团受体提供荧光，荧光团受体发出荧光，从而 可以根据荧光团受体发出荧光的变化量来确定解链峰值所对应的温度值，该温度值低于解 链温度时则确定目的核酸中存在一单核苷酸多态性。这种方法中随着探针的脱落，荧光强 度由大变小。这种方法中对可与探针的寡核苷酸链结合的荧光团供体或荧光团受体的选取 有一定的要求，因而成本较高。中国专利文献CN1952178A公开了一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸性质的方法。该 方法具有如下步骤①确定待测DNA片段的一条单链上的第一序列和第二序列、且第一 序列可能具有变异位点，第二序列是指与第一序列核苷酸相靠近的一段核苷酸序列；②制 备分别对应于第一序列的敏感探针和对应于第二序列锚定探针，敏感探针的一端仅一端结 合有荧光报告基团(也可称为荧光基团)和淬灭基团中的一种，锚定探针的一端仅一端结 合有荧光基团和淬灭基团中的另一种；③制备与待测DNA片段相对应的一对引物；④由 过量的底物、DNA聚合酶、过量的寡核苷酸引物、以及含有待测DNA片段的脱氧核糖核 酸组成反应体系，还加入碱基淬灭探针，然后在上述反应体系中进行聚合酶链式反应，而 使上述待测DNA片段扩增；⑤加热至使扩增后的待测DNA片段变性而使其双链解开，然 后降温而使敏感探针和锚定探针杂交于扩增后的待测DNA片段的含有第一序列和第二序 列的单链上；由于荧光报告基团与淬灭基团相互临近且数量相当，所以若此时对探针上的 荧光报告基团进行激发，则其所被激发出的荧光被结合于同一条链上的另一个探针的荧光 淬灭基团淬灭，对外不显示荧光；⑥加热杂交后的体系，结合于待测DNA片段的单链上 的第一序列上的敏感探针会先脱落下来，若此时对探针上的荧光报告基团进行激发，则因 为敏感探针的脱落而对外显示出荧光，随着温度的继续升高，敏感探针脱落增加，荧光强 度也随着增强，将其中的荧光强度增量变化最大时的温度作为融解温度；若该融解温度值 与同样条件下野生型基因的相应的DNA片段的相应的融解温度值之间有明显的差别，则 说明所测脱氧核糖核酸具有单核苷酸多态性。该方法虽然具有成本较低、操作方便、检测 时间较短的特点，但需要准备两种探针和两种荧光标记，从而在进行探针的设计(包括确 定核苷酸序列以及将荧光基团或淬灭基团连接在(或称标记)核苷酸序列的一端的核苷酸 上)时，可供选择的寡核苷酸的范围还有待增加、相应的成功率也有待于增加。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种成本更低、操作更方便、检测时间更短的检测脱氧核糖核酸 的单核苷酸多态性的方法，且该方法所采用的探针在设计时可供选择的寡核苷酸的范围更 大、相应的成功率则更高。本专利技术的总的技术构思是本专利技术的方法包括确定待测DNA片段的一条单链上的包含 变异位点的靶序列，制备对应于靶序列的碱基淬灭探针，探针的一端仅一端结合有荧光基 团，制备与待测DNA片段相对应的一对引物，然后进行聚合酶链式反应，再将探针杂交于 扩增后的待测DNA片段的含有变异位点的耙序列上，再测定融解温度，即可对待测DNA片 段的变异位点的单核苷酸是否具有单核苷酸多态性进行判断。实现本专利技术目的的提供的技术方案 是具有以下歩骤-① 确定要对某种生物的脱氧核糖核酸的某种基因进行检测，也就是确定待测DNA片 段，而该待测DNA片段的一条单链上的一段核苷酸序列中的某一个特定核苷酸可能发生变 异；这段包含可能发生变异的特定核苷酸的核苷酸序列可称为靶序列；而其中的可能发生 变异的特定核苷酸所处的位置可称为变异位点；② 制备一种由寡核苷酸和荧光基团组成的碱基淬灭探针；碱基淬灭探针的寡核苷酸互 补于与待测DNA片段的靶序列相对应的野生型基因的相应DNA片段的相应序列、或互补于 与待测DNA片段的靶序列相对应的突变型基因的相应DNA片段的相应序列，碱基淬灭探针 的寡核苷酸的一端仅一端结合有荧光基团，荧光基团可以标记在碱基淬灭探针的寡核苷酸 的5'或3'端，当荧光标记在5'端时，探针的寡核苷酸的3，端必须采用磷酸基团进行封 闭； '③ 制备合适的两个寡核苷酸引物，该两个寡核苷酸引物中的一个寡核苷酸引物与上述 待测DNA片段的一条单链的一端的一段序列互补，该两个寡核苷酸引物中的另一个寡核苷 酸引物与上述待测DNA片段的另一条单链的另一端的一段序列互补；④ 由过量的底物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，具有以下步骤：　　　　①确定要对某种生物的脱氧核糖核酸的某种基因进行检测，也就是确定待测ＤＮＡ片段，而该待测ＤＮＡ片段的一条单链上的一段核苷酸序列中的某一个特定核苷酸可能发生变异；这段包含可能发生变异的特定核苷酸的核苷酸序列可称为靶序列；而其中的可能发生变异的特定核苷酸所处的位置可称为变异位点；　　　　②制备一种由寡核苷酸和荧光基团组成的碱基淬灭探针；碱基淬灭探针的寡核苷酸互补于与待测ＤＮＡ片段的靶序列相对应的野生型基因的相应ＤＮＡ片段的相应序列、或互补于与待测ＤＮＡ片段的靶序列相对应的突变型基因的相应ＤＮＡ片段的相应序列，碱基淬灭探针的寡核苷酸的一端仅一端结合有荧光基团，荧光基团可以标记在碱基淬灭探针的寡核苷酸的５’或３’端，当荧光标记在５’端时，探针的寡核苷酸的３’端必须采用磷酸基团进行封闭；　　　　③制备合适的两个寡核苷酸引物，该两个寡核苷酸引物中的一个寡核苷酸引物与上述待测ＤＮＡ片段的一条单链的一端的一段序列互补，该两个寡核苷酸引物中的另一个寡核苷酸引物与上述待测ＤＮＡ片段的另一条单链的另一端的一段序列互补；　　　　④由过量的底物、ＤＮＡ聚合酶、过量的寡核苷酸引物、以及含有待测ＤＮＡ片段的脱氧核糖核酸组成反应体系，还加入碱基淬灭探针，在上述反应体系中进行聚合酶链式反应，而使上述待测ＤＮＡ片段扩增；　　　　⑤对上述进行聚合酶链式反应后的体系加热，直至使扩增后的待测ＤＮＡ片段变性而使其双链解开，然后降温而使碱基淬灭探针的寡核苷酸杂交于扩增后的待测ＤＮＡ片段的单链的靶序列上，此时的碱基淬灭探针的寡核苷酸处于与靶序列互补的状态；若在碱基淬灭探针的寡核苷酸处于单链状态时对碱基淬灭探针的荧光基团进行激发，则与荧光基团毗连的碱基对荧光基团所发荧光的淬灭作用较弱，若在碱基淬灭探针的寡核苷酸与靶序列杂交生成双链后的互补状态下对碱基淬灭探针的荧光基团进行激发，则与荧光基团毗连的碱基对荧光基团所发荧光的淬灭作用加强；　　　　⑥在对探针的荧光基团进行激发的同时，加热杂交后的体系，结合于待测ＤＮＡ片段的单链的靶序列上的碱基淬灭探针会脱落下来，碱基淬灭探针的脱落使其恢复到单链状态而对外显示出的荧光增强，随着温度的继续升高，碱基淬灭探针脱落增加，荧光强度也随着增强，将其中的荧光强度增量变化最大时的温度作为融解温度；若该融解温度值与同样条件下野生型基因的相应的ＤＮＡ片段的相应的融解温度值之间...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗光华，郑璐，
申请(专利权)人：常州市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]