一种检测石蜡标本ＤＮＡ甲基化的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测石蜡标本ＤＮＡ甲基化的方法，包括如下步骤：石蜡切片脱蜡、细胞裂解、ＤＮＡ亚硫酸氢钠修饰、脱磺化、修饰后的ＤＮＡ纯化、ＰＣＲ扩增和检测分析，整个修饰过程ＤＮＡ没有从切片中抽提出来，ＤＮＡ修饰、脱磺化等操作均在细胞内进行，不仅节省了时间，而且避免了因酚氯仿抽提过程中ＤＮＡ的反复沉淀、溶解转移而造成的ＤＮＡ损失和断裂，还有利于环境保护。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学生物学检测
，具体是一种检测石蜡标本 DNA甲基化的方法。
技术介绍
DNA甲基化异常与肿瘤的发生、发展密切相关。近年来有关DNA 甲基化与肿瘤发生的关系日益受到人们的重视，成为肿瘤分子生物学 研究热点之一。DNA甲基化的主要研究方法有甲基化特异性PCR。以往实验多采用新鲜组织，研究样本来源有很大的局限性，而石 蜡标本来源丰富，而且可以针对新课题做回顾性分析，弥补了新鲜组 织标本存在的取材不易及保存困难等缺点，为临床和科研提供了有利 的帮助，因此大大的方便了实验研究。传统的从石蜡标本中制备检测DNA甲基化的方法，主要过程如下1、制备待测DNA:1) 脱蜡将石蜡标本切片用二甲苯脱蜡2次，再用无水乙醇洗涤 2次，组织千燥后，用基因组DNA抽提试剂盒制备DNA;2) 细胞裂解加裂解液，在55'C下用蛋白酶K消化12—24小时；3) 抽提DNA:用酚氯仿抽提两次；4) 沉淀DNA:用无水乙醇沉淀，70%酒精洗涤，凉干备用。2、 DNA亚硫酸氢钠修饰1) DNA解链将h述制备的DNA变性，成为单链DNA，使碱 基充分暴露；2) DNA亚硫酸氢钠修饰将上述单链DNA与亚硫酸氢钠反应， 使DNA单链上未甲基化的胞嘧啶被修饰成磺化胞嘧啶，脱氨基，该 磺化胞嘧啶变为磺化尿嘧啶；而5'-甲基化胞嘧啶不能被修饰；3) 脱磺化将修饰后的DNA产物经过透析脱盐，用氢氧化钠脱 磺化，使得磺化尿嘧啶变为尿嘧啶，亦即原来没有甲基化的胞嘧啶碱 基变为尿嘧啶；而甲基化的胞嘧啶不变。3、 纯化上述修饰的DNA用酒精沉淀、洗涤，用作PCR模板。4、 PCR扩增和检测分析将纯化的DNA修饰产物溶解于TE，用设计 的待测基因的正、反向甲基化特异性引物和未甲基化特异性引物进行 PCR扩增。将PCR扩增产物与标准品进行凝胶电泳检测或DNA测序分析，就可确定该基因的胞嘧啶甲基化程度。如果其中多数基因发生异 常甲基化，则就提示该患者可能得相应的癌症。具体步骤主要为1、 制备待测DNA:按常规方法脱蜡和从组织中抽提DNA。2、 DNA亚硫酸^l钠修饰1)、取1吗DNA，溶于20nl水中，951C水浴10分钟；立即放于 冰浴加入2n!10M氢氧化钠，使DNA变性，成为单链DNA;2)、加入亚硫酸氢钠修饰液230lU (3M亚硫酸氢钠，lOmM氢醌， PH5.0);置于55'C避光修饰16小时，DNA被修饰，未甲基化的胞 嘧啶被修饰为磺化尿嘧啶。3. DNA修饰产物的纯化1) 将上述DNA修饰产物在4"C下用双蒸水透析过夜，去除多余 的亚硫酸氢钠；2) 脱磺化加入10MNaOH使其终浓度为0.3M，室温20分钟； 再加入等当量的1M盐酸中和NaOH，磺化尿嘧啶脱磺化后成尿嘧啶;.3) 沉淀加入四分之一体积的10M醋酸铵和2倍体积乙醇，将 DNA修饰产物置于-20'C沉淀过夜；4) 洗涤13000rpm离心10分钟，弃上清，用70%酒精洗涤2次；干燥10分钟，得纯化的DNA修饰产物，亦即PCR模板。4. PCR扩增和检测分析将纯化的DNA修饰产物溶解于20jilTE，用设计的待测基因的正、反向甲基化特异性引物和未甲基化特异性弓I物进行PCR扩增。 PCR反应体系如下10xPCR buffer (without MgCl2) 2.5^1MgCl2 (25mM) 2ji1dNTP (2.5mM) 2jdIH向引物(20pM) 0.5jil反向引物(2(HiM) 0.5^1H20 16nl 模板T叫酶(5, 0.5pl总体积 25jd反应条件如下94匸3分钟 94 "€ 20秒, 58*€ 20秒35循环 72。C 15秒一 72*C 5分钟检测分析将PCR扩增产物与标准品进行凝胶电泳检测或DNA测 序分析，就可判断该基因的胞嘧啶甲基化程度。但是上述方法存在如F不足1、由于组织经甲醛固定后DNA的 嘌呤基之间及碱基与组蛋白之间形成了以甲醛为介体的甲基桥，造 成DNA交联，这种交联的DNA从石蜡包埋组织中提取时容易随机降 解；2、由于在酚氯仿等的抽提过程中，经过震荡，DNA也将发生部 分断裂，因此从石蜡标本提取的DNA比较短，通常是弥散的一片， 碱基长度从100到2000都有；3、 DNA在亚硫酸氢钠修饰时会发生脱 嘌呤作用而产生断裂，这使得石蜡标本的DNA用于甲基化特异性PCR 更为困难此外，这种传统的方法操作麻烦，耗时长，工作量大，需 要接触有毒药物酚氯仿等，自1985年Goelz等首先从10%甲醛固定 石蜡包埋组织中提取出了DNA之后，许多学者对石蜡包埋组织提取 DNA的方法进行了研究，但现有的文献报道看，这种方法获得的DNA 模板PCR成功率不高，结果很不稳定，重复性差，制约了石蜡标本的 利用。
技术实现思路
本专利技术的S的是提供一种快速方便、结果稳定、重复性好的检测 石蜡标本DNA基因甲基化的方法。本专利技术方法的关键在于改变了以往的操作模式，先不将DNA从 标本组织中提取出来，而是将石蜡标本切片先固定在载玻片或过滤柱 上，再依次进行脱蜡、水化、高浓度亚硫酸氢钠修饰、脱磺化处理， 最后用裂解液和蛋白酶K消化后从细胞中释放出DNA修饰产物，转 移到离心管中，用作PCR模板。 主要步骤如卜'1、 固定石蜡切片将石蜡切片固定于载玻片或过滤柱上；2、 脱蜡用二甲苯脱蜡，再用酒精将组织细胞水化；3、 DNA亚硫酸氢钠修饰直接在载玻片或过滤柱上进行细胞内DNA 的亚硫酸氢钠修饰；4、 脱磺化处理修饰后的DNA在细胞内进行脱磺化处理；5、 裂解和消化细胞加入裂解液和蛋白酶K消化，修饰后的DNA 被释放；消化产物离心，取上清，置851C10分钟，使蛋白酶K灭活 后，可直接作为模板进行PCR扩增，或置一20^C保存；6、 PCR扩增和检测分析同上述传统方法。本专利技术方法由T先将石蜡切片固定于载玻片或过滤柱上，再进行 脱蜡、脱磺化等操作，最后通过细胞裂解，消化将修饰后的DNA释 放出来；整个修饰过程DNA没有从切片中抽提出来，DNA修饰、脱磺化等操作均在细胞内进行，不仅节省了时间，而且避免了因酚氯仿抽提过程中DNA的反复沉淀、溶解转移而造成的DNA损失和断裂， 还有利于环境保护。附图说明图l:为实施例1检测乙状结肠癌(030081D)、胃角腺癌III级 (0300卯B)、胃窦腺癌(030083C)、卵巢癌(030082C)石蜡标本 GSTP1基因的PCR产物电泳图谱。图2:为实施例2检测乙状结肠癌(030081D)、胃角腺癌in级 (030090B)、胃窦腺癌(030083C)、卵巢癌(030082C)石蜡标本 p16基因的PCR产物电泳图谱。具体实施例方式现结合实施例对本专利技术作详细描述。但本实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本专利技术的保护范围。 主要仪器及试剂来源Eppendorf Model 5415R, Centriftiges低温微高速离心机，英国 TECHNE公司产品；TC-512梯度PCR仪，英国Techne公司产品； FR-200A全自动紫外与可见分析装置，上海复日科技有限公司公司产 品；亚硫酸氢钠购自国药集团，盐酸胍购自国药集团，氢醌购自上海 生工生物工程技术服务有限公司。实施例1.检测结肠癌、胃癌、肝痛、卵巢癌石蜡标本中GSTP1基 因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测石蜡标本ＤＮＡ基因甲基化的方法，包括如下步骤：石蜡切片脱蜡、细胞裂解、ＤＮＡ亚硫酸氢钠修饰、脱磺化、修饰后的ＤＮＡ纯化、ＰＣＲ扩增和检测分析，其特征在于先将石蜡标本切片固定在载玻片或过滤柱上，直接依次进行脱蜡、酒精水化、亚硫酸氢钠修饰、脱磺化处理，再用裂解液和蛋白酶Ｋ消化后从细胞中释放出ＤＮＡ修饰产物，纯化后用作ＰＣＲ模板。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卫立辛，张春东，蒋国成，程越，郭献灵，吴孟超，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]