一种Ｓｏｌｅｘａ技术鉴定糖尿病病人血清中微小核糖核酸的方法，属于生物医药技术领域，具体涉及一种研究血清中微小核糖核酸表达的Ｓｏｌｅｘａ技术以及Ｓｏｌｅｘａ技术在糖尿病诊断中的应用。该方法包括应用Ｓｏｌｅｘａ测序方法测定初发糖尿病受试者的血清微小核糖核酸表达谱。此Ｓｏｌｅｘａ测序的方法具有检出谱系广、灵敏度高、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于疾病普查等相关工作，改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高疾病的临床检出率，成为早期诊断疾病的有效手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
具体涉及一种测定血清微小核糖核酸表达的 Solexa技术，以及Solexa技术在糖尿病临床诊断方面的应用。二
技术介绍
近年来，随着人民生活水平的提高，糖尿病患病率正呈逐年上升趋势。糖尿病特 点是慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱， 造成多器官慢性损害、功能障碍和衰竭。糖尿病危害严重性不仅在于急性并发症导致 生命危险，更为严重的是糖尿病引起的多系统损害和各种慢性并发症，导致人们生活 质量的明显下降。因此，早期诊断和治疗糖尿病显得至关重要。目前糖尿病主要诊断方法有U)血糖测定。(2) 口服葡萄糖耐药实验(0GTT)。 (3)血清中胰岛细胞自身抗体UCA)、抗胰岛素自身抗体(IAA)、谷氨酸脱羧酶抗 体(GAD-Ab)的联合检测。然而上述方法临床应用的灵敏度和特异性还存在着明显不 足，还不能满足对糖尿病早期发现和早期诊断的需要。例如，测定的血糖即使不在正 常范围，也不能作为诊断糖尿病的完全依据，因为急性感染等应急情况也可导致血糖 升高。空腹血糖正常，但尿糖阳性或有糖尿病家族史等症状的患者必须做OGTT检查以 帮助诊断。其它方法如糖化血红蛋白(HbAlc)和果糖胺(Fruc)的检测以及血浆胰岛 素及C肽测定对于糖尿病的诊断有重要价值，但不能作为诊断糖尿病的依据。因此目 前非常有必要研究高灵敏性和特异性的新型糖尿病早期检测标记物。微小核糖核酸与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞调 亡以及能量代谢等密切相关。已有大量研究证明微小核糖核酸与许多疾病的发生及发 展存在着紧密联系，例如它能影响心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等心血管疾病的发 生和发展，并且与II型糖尿病等代谢性疾病有密切关联。本专利技术人已经开展了以微小 核糖核酸作为疾病标志物的相关领域的研究，例如选取占恶性肿瘤发病率第4位的结 肠癌作为研究对象，经研究发现，在结肠良性息肉发展成恶性肿瘤期间， 一些微小核 糖核酸分子都存在着特异性变化，并据此通过测定微小核糖核酸的特异性变化已经建 立起一种更敏感、更精确的早期确诊结肠癌的方法；另外本专利技术人已经申请了 "血清 中微小核糖核酸的应用"的专利。这些研究结果表明微小核糖核酸特异性变化与疾病 发生存在着必然联系，可以作为一类新的疾病标志物分子用于糖尿病的早期检测。目前常用RT-PCR、 Real-time PCR、 Northern blotting、 RNase protection assay 和生物芯片等方法研究微小核糖核酸。但是这些方法都有其不足之处。RT-PCR和 Rea卜time PCR存在实验费用高、通量较低等问题。Northern blotting虽然能直观地检 测前体和成熟体微小核糖核酸，但是操作繁琐、敏感性和实验通量低。生物芯片技术虽 然高通量、低成本，但是敏感性和重复性都需要提高。 一种革新性的能够在整个基因组 水平上区分单个碱基差异的分子生物学综合技术Solexa方法正在进入人们视野。 Solexa技术有如下独特优点1)不受物种限制，人，动物，微生物，植物都可进行 研究；2)高灵敏度，高精确性，高通量和高重复性和低运行成本；3)无需预先知道 模式物种基因组序列，无须合成探针，可直接进行全基因组表达研究；4)不需要实验 假设的支持；5)可以检测到单拷贝分子的变化；6)没有传统方法的荧光背景噪音的 干扰。应用Solexa技术可以同时完成传统基因组学研究(测序和注释)以及功能基因 组学(基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用)的研究。我们通过Solexa方法来研究糖尿病人血清微小核糖核酸的表达谱及其与疾病的 相关性，应用Solexa方法筛选和鉴定糖尿病血清中微小核糖核酸及其在糖尿病发生过 程中的特异性变化，建立一种用于糖尿病早期诊断，病程监控，并发症发生的预测， 药效判定，个体化治疗和疾病分型等方面的新技术。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是用Solexa测序技术检测糖尿病人血清中微小核糖核酸 并分析鉴定其稳定性和表达量。本专利技术涉及糖尿病人血清中微小核糖核酸的提取方法。本专利技术还涉及Solexa测序技术分析并鉴定糖尿病人血清中微小核糖核酸的表达谱。本专利技术提供一种评价糖尿病人病理状态的微小核糖核酸组合，所述组合包括 Solexa方法能够检测的糖尿病病人血清中全部微小核糖核酸，将其与正常人血清中微 小核糖核酸表达谱进行比较，筛选出特异性变化的一系列微小核糖核酸，用于疾病的 诊断、药物的筛选、治疗方案的评价。实现本专利技术目的的技术方案为取得正常人和初发糖尿病人的血清样本，通过 Solexa测序技术分析并鉴定糖尿病人血清中微小核糖核酸。通过与糖尿病人血清中微 小核糖核酸的PCR产物进行序列比对，进一步验证血清微小核糖核酸分子的存在和序 列的正确性。Solexa测序可得到糖尿病人血清微小核糖核酸表达谱中各个微小核糖核 酸的含量和所占比例，通过与正常人血清中微小糖核酸Solexa测序结果比对，可以筛 选出在病理状态下差异表达程度大的一系列血清微小核糖核酸分子，作为糖尿病早期检测的标记分子。 具体的糖尿病人血清微小核糖核酸的制备及分析如下(1) 收集初发糖尿病受试者的血清样本；(2) 通过Trizol试剂提取血清总RNA;(3) 进行PAGE电泳回收17-27nt RNA分子；(4) 进行Solexa技术的准备实验，首先在17_27nt RNA分子两个末端加上接头 (adapter);(5) 利用Solexa芯片固定单链RNA分子芯片表面连接有一层单链引物(Primer)，单 链RNA通过芯片表面引物的碱基互补被一端"固定"在芯片上；(6) 引物扩增使得单链RNA成为双链；(7) 将双链RNA变性后成为单链，其一端"固定"在芯片上，另外一端(5'或3，)随 机和附近的另外一个引物互补，被"固定"住，形成"桥"(bridge);(8) 上千万RNA单分子发生同样反应形成单链桥；(9) 单链桥以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行"桥式PCR"扩增形成双链；(10) 双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板，反复30轮扩增后每个 单分子得到了 IOOO倍扩增，成为单克隆簇；(11) 利用"可逆性末端终结反应"进行序列分析通过碱基合成来进行测序。四种碱 基分别标记四种不同荧光，每个碱基末端被保护基团封闭，单次反应只能加入一个碱基， 经过扫描，读取该次反应颜色后，该保护基团被除去，下一个反应可继续进行，如此反 复，得出碱基的精确序列；(12) 数据分析与处理。通过上述Solexa测序技术分析糖尿病人血清相对于正常人血清中微小核糖核酸 的变化趋势和变化量及它们与糖尿病发生的相关性。确定基于Solexa测序技术的标志 性微小核糖核酸作为糖尿病早期发生的临床诊断标准。本专利技术利用Solexa测序技术对糖尿病人血清微小核糖核酸表达谱测定的应用与 现有技术相比有其优越性(1) Solexa测序技术具有高的灵敏度，精确性和重复性。在糖尿病人血清微小核 糖核酸表达谱的测定中可以检测到单拷贝分子的变化。再加上样本易存放(血液-20°C 存放即可)等优点，该方法可广泛用于疾病谱査等相关工作，成为早期诊断疾病的有 效手段。(2) 利用S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Ｓｏｌｅｘａ技术鉴定糖尿病人血清中微小核糖核酸的方法，其特征是由以下步骤构成： （１）收集正常受试者和初发糖尿病受试者的血清样本； （２）通过Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取血清总ＲＮＡ； （３）进行ＰＡＧＥ电泳回收１７－２７ｎｔ ＲＮＡ分子； （４）进行Ｓｏｌｅｘａ技术的准备实验，在１７－２７ｎｔ ＲＮＡ分子两个末端加上接头ａｄａｐｔｅｒ； （５）小ＲＮＡ接头分子一端固定在Ｓｏｌｅｘａ芯片表面上，并进行“桥式”ＰＣＲ扩增反应； （６）利用可逆性末端终结反应，通过四种荧光碱基的合成进行测序； （６）数据分析与处理。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张峻峰，郭继刚，张玉婧，陈江宁，陈熹，殷媛，蔡星，王可慧，张辰宇，王进，曾柯，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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