本发明专利技术涉及两对寡核苷酸，其用于扩增分别位于流感Ａ病毒基因组的Ｈ５和Ｎ１基因中的两个靶序列，所述寡核苷酸的长度为１０－５０个核苷酸，并且包括源自以下序列的至少１０个连续核苷酸的片段：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１：ＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２：ＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３：ＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＡ，和ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４：ＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡ，或其互补序列。本发明专利技术还涉及用于检测扩增子的寡核苷酸，所有上述序列的用途，检测流感Ａ病毒的Ｈ５和Ｎ１基因的方法。本发明专利技术具体可用于诊断领域。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于诊断流感A病毒的H5和N1基因的存在的 寡核苷酸，其用途，检测方法和试剂盒本专利技术涉及在存在至少一种固相支持物的条件下标记核酸的方法。 本专利技术涉及寡核苷酸，其分别用于扩增和检测位于流感A病毒基因组的H5和N1基因中的两个耙序列。本专利技术还涉及利用这些寡核苷酸的用途，用于检测流感A病毒的H5和N1基因的存在的方法和用于诊断流感A病毒的H5和N1基因的存在的试剂在通常用于诊断流感的常规技术中，通常涉及凝集作用，抑制凝集作 用或琼脂凝胶中的扩散。这些方法通常被使用并使得可以定性流感病毒A。这些方法的可选替代是在胚胎阶段的鸡卵中或在MDCK细胞中根据 IOE手册中的方案进行病毒培养。然而， 需要数天才能获得定性结果，这一延迟有时与临床需要或紧急情况有矛盾。用于检测抗体或抗原的ELISA技术或免疫荧光检测也得到极大发展， 但这些"免疫学"检测方法与常规病毒培养相比通常敏感性和特异性较低。最近高致病形式的禽流感病毒H5N1亚型的出现重新唤起了对快速、特 异性且高敏感性诊断检测的需要。为此，上述各种方法已经逐渐被"分子" 技术取代，诸如RT-PCR技术(与聚合酶链反应相关的逆转录)。RT-PCR 更为敏感，不需要样品中存在"活"病毒，由此使得将流感病毒的各种形 式分类并分成亚类成为可能。该实时技术("实时RT-PCR")的发展也极 大促进了其在诊断A型病毒中的应用。例如，D.M. Whiley等在最近公开的文献(Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases (2005)， in press)中描述了用于检测临床样品中的广谱流 感病毒亚型的实验，其基于涉及5，-核酸酶的RT-PCR反应。选择两种寡核苷 酸和探针，其与编码A病毒的23种亚型的M (基质)蛋白的基因同源。该检测由此使得检测临床样品中的流感A病毒成为可能，但是另一方面，仍不能精确检测所涉及类型的亚类。E.K.O. Ng等最近公开(Emerging Infectious Diseases (2005) vol. 11 (8)， p. 1303-1305)了基于多重RT-PCR反应的检测，其包含两个步骤，利用两组 寡核苷酸和标记的探针，从而特异性耙向H5N1的HA基因的两个区域。这样 使得能够开发快速并敏感地直接检测人样品中的H5亚型的检测法。该检测 法已经在临床样品中证实，所述样品源自在香港和越南的感染流感病毒 H5N1亚型的患者，但仍不能直接诊断所感染病毒的亚型。S. Payungporn等描述(Viral Immunology (2004) vol. 17 (4)， p. 588-593 and Journal of Virological Methods (2005)， in press)同时检测H5N1亚型的M， H5和N1序列的方法，其基于实时多重RT-PCR检测法并一步完成。对应M, H5和Nl序列的寡核苷酸以及各种标记的TaqMan探针被选择并用于该检测 法中从而同时检测三种荧光信号。H5和N1寡核苷酸从覆盖H5N1病毒的50 个已知特异性序列的不变区中选择。但应注意该RT-PCR方法为非等温的， 有时易于发生污染。另一种可用于检测感染因子存在的分子方法是NASBA技术(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)。例如，R.A. Collins等描述(Journal of Virological Methods (2002) vol. 103， p. 213-225 and Avian Diseases (2003) vol. 47(3)， p. 1069-1074)了禽流感H5亚型的检测(检测高致病性以及弱致病性 亚型)，其利用与ECL (电子化学发光法)检测系统结合的NASBA技术。 NASBA技术是涉及多种酶活性的核酸的等温扩增，其允许快速检测H5病 毒。通过该方法扩增核酸适合RNA基因组，诸如流感病毒基因组，通过将 逆转录步骤直接引入扩增反应。然而，尽管这篇文献中描述的方法使得可 能检测并却分弱致病性菌株和高致病性菌株，仍不能特异性鉴别该菌株的 H5N1型。利用转录扩增技术鉴别H5N1形式的流感A病毒的检测法，其尤其适合 扩增和检测RNA病毒，由此仍有待开发。此外，多重检测法，即能同时扩增并检测H5和N1两个基因的检测法，其中的扩增技术是转录扩增技术诸如 NASBA，尤其有利。本专利技术由此涉及两对寡核苷酸，其分别用于扩增位于流感A病毒基因组 的H5基因和N1基因中的两个耙序列，其中用于扩增H5基因的寡核苷酸对由 以下寡核苷酸组成-第一寡核苷酸，其长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷 酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQ ID No. 1: TGTATGTTGTGGAATGGCA或其互补序列，禾口-第二寡核苷酸，长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸 的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQ ID No. 2: GCCGAATGATGCCATCAA或其互补序列，其中用于扩增N1基因的寡核苷酸对由以下寡核苷酸组成-第一寡核苷酸，其长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷 酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQ ID No. 3: CGTGGATTGTCTCCGAAA或其互补序列，禾口-第二寡核苷酸，长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸 的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQ ID No. 4: GGAATGCTCCTGTTATCCTGA或其互补序列。本专利技术还涉及寡核苷酸对，用于扩增位于流感A病毒基因组的H5基因 中的靶序列，所述寡核苷酸对由以下寡核苷酸组成-第一寡核苷酸，其长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷 酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQ ID No. 1: TGTATGTTGTGGAATGGCA或其互补序列，禾口-第二寡核苷酸，长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸 的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQ ID No. 2: GCCGAATGATGCCATCAA或其互补序列。类似地，本专利技术还涉及这样的寡核苷酸对，用于扩增位于流感A病毒基因组的N1基因中的耙序列，所述寡核苷酸对由以下寡核苷酸组成-第一寡核苷酸，其长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷 酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQ ID No. 3: CGTGGATTGTCTCCGAAA或其互补序列，和-第二寡核苷酸，长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸 的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQ ID No. 4: GGAATGCTCCTGTTATCCTGA或其互补序列。在上述三种情况中，在寡核苷酸对中，第一寡核苷酸还包括可被DNA-依赖性RNA聚合酶识别的启动子序列。根据上述两种情况，其中当添加了启动子序列的寡核苷酸使得可能扩 增位于H5基因中的耙序列时，其基本上由以下序列组成SEQ ID No. 5: aattctaatacgactcactataggggTGTATGTTGTGGAATGGCA， 或其互补序列。该序列中的小写字母对应T7本文档来自技高网...
【技术保护点】
两对寡核苷酸，其分别用于扩增位于流感Ａ病毒基因组的Ｈ５基因和Ｎ１基因中的两个靶序列，其中用于扩增Ｈ５基因的寡核苷酸对由以下寡核苷酸组成：－第一寡核苷酸，其长度为１０－５０个核苷酸，包含至少一个１０个连续核苷酸的片段，所述１０个连续核苷酸源自ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１：ＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡ或其互补序列，和－第二寡核苷酸，长度为１０－５０个核苷酸，包含至少一个１０个连续核苷酸的片段，所述１０个连续核苷酸源自ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２：ＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡ或其互补序列，其中用于扩增Ｎ１基因的寡核苷酸对由以下寡核苷酸组成：－第一寡核苷酸，其长度为１０－５０个核苷酸，包含至少一个１０个连续核苷酸的片段，所述１０个连续核苷酸源自ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３：ＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＡ或其互补序列，和－第二寡核苷酸，长度为１０－５０个核苷酸，包含至少一个１０个连续核苷酸的片段，所述１０个连续核苷酸源自ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４：ＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡ或其互补序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：A勒弗夫尔，JN特莱斯，G韦尔内，
申请(专利权)人：生物梅里埃公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]
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