高致病性蓝耳病的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种关于高致病性蓝耳病的环介导等温扩增快速检测技术，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术（ＲＴ－ＬＡＭＰ）平台扩增靶序列的特定区域，在一系列质控和阴性、阳性对照的辅助下，从分子水平对包括高致病性蓝耳病毒核酸进行检测，本发明专利技术的方法具有简便、经济、快速、灵敏和特异的特点，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于一种检测技术，确切讲是一种检测猪是否患有高致病性蓝耳病 的方法。
技术介绍
高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株引起的一种急性高致死性疫病。仔猪发病率可达100%、死亡率可达50%以上，母猪流产率可达30 %以上，育肥猪也可发病死亡。其病理特征为脾脏边缘或表面出现梗死灶，显 微镜下见出血性梗死；肾脏呈土黄色，表面可见针尖至小米粒大出血点斑，皮 下、扁桃体、心脏、膀胱、肝脏和肠道均可见出血点和出血斑。显微镜下见肾 间质性炎，心脏、肝脏和膀胱出血性、渗出性炎等病变；部分病例可见胃肠道 出血、溃疡、坏死。猪是PRRSV的唯一自然宿主，各种品种、年龄和各种饲养 条件下的猪只均可感染。急性爆发期可持续2-4个月，急性期过后转为慢性或亚 临床感染。自临床上首次发现后，高效传染就是PRRS的一个标志。由于缺乏有 效控制或疫苗，不能阻止病毒的排出，对携带动物亦不能消除其感染，预防控 制PRRSV的方法必须建立在对传染方式的透彻把握。猪可以通过口腔、鼻内、 肌肉、腹膜和阴道感染PRRSV。病毒具有高度感染性，通过肌肉或鼻内接种IO 个或更少的病毒粒子即可感染发病，通过腹腔或尾软骨注射其最小感染剂量为 近l个病毒粒子。相反，通过粘膜表面接种如眼、阴道或口腔途径，最小感染量 为10" -1053个病粒子，其剂量有赖于特定的解剖部位。感染PRRSV的猪在临床症状消失8周后仍排毒，且PRRSV可在猪上呼吸道和 扁桃体存活约5个月以上的时间，因此带毒猪是病毒的主要来源。仔猪可成为自 然带毒者。病毒在猪群中生存、循环及再次传播。造成感染及未感染猪之间的 直接或间接接触传播。尤其是引进带病毒血症的后备种猪与原猪群的平行和垂 直传播为其主要传播途径，不同的猪群还可通过感染公猪精液传播。含有PRRS 病毒的粪、尿等排泄物也是潜在的污染源。空气传播是PRRS的又一重要传播途 径，特别是在短距离内(〈km)传播更具有重要的作用。以发病点为原点，半径 500米以内的区域，有45%的猪场可感染，而距暴发点l-2km的区域仅2y。的猪场感染。此外，病毒在低温潮湿条件下容易存活，因此气温低，湿度高，风速大 和紫外线照射强度下降等皆可加快该病的传播。PRRS临床表现的显著特征是产前一周发生流产或分娩提前，生产成绩显著 下降。在同一猪场内爆发本病停息后，还易再度暴发，其发病率显著增高。潜 伏期因饲养环境不同有很大差异，该病的潜伏期在仔猪为2-4天，孕猪为4-7天。 不同毒株致病性的差异或许会造成不同的潜伏期。 一般流行期为70-100天，最长 可达4-6个月。青年猪感染后症状较为温和，母猪和仔猪症状较严重，母猪的死 亡率较低，乳猪的死亡率很高。本病在仔猪之间的传播比成年猪之间的传播更 为容易。流行后隐性感染病例增多，无临床症状的猪也能传播本病，并持续数 月。高致病性蓝耳病在我国的广泛传播给养猪业带来的严重危害，世界各国对 本病给予了高度重视，并投入了大量的人力物力对其进行研究。鉴于高致病性 蓝耳病的生物学特性和流行病学特征，.要在一个高致病性蓝耳病流行的国家和 地区消灭该病几乎无法完成，从长远观点看，这也将是一项非常艰巨的任务。现有技术中检测猪高致病性蓝耳病多采用ELISA法或RT-PCR法，但这些 方法检测需时较长，检测要求的仪器条件较高，而且检测的灵敏度相对较低。
技术实现思路
本专利技术提供一种可克服现有技术不足，具有快速、简便、灵敏和经济的用 于检测猪高致病性蓝耳病的方法，这种方法不仅既适用于检测死猪，也适用于 活猪检测。本专利技术的检测方法是采集被检死猪的脑或肠内容物或肺或肾或肠或脾或肝 或心组织，或者采集被检活猪的血液或口拭子或粪便，从所采样品中提取RNA， 以提取的RNA为模板，以外侧上、下游引物和内侧上、下游引物进行RT-LAMP 反应，RT-LAMP反应结束后取样进行琼脂糖凝胶电泳检测。本专利技术的检测方法中，所用的外侧上、下游引物和内侧上、下游引物分别为______引物名称 引物序列F 5'- GCTCCGCGCAGGAAGGTCA -3B 5'- GTGCGTCAGCGTTGTTGTC -35'- GGATGGTGTCGGAAAATTG TTTTT CCTAACGGTTCGG'AAGAAA -3'FIP5'- CGTCGCGACGTGTCCCCAA TTTTT CCACTCAAAGGTGTCATCA -3'B1P本专利技术是利用环介导等温扩增技术，即RT-LAMP技术。这一技术是从猪病 料中提取核酸，利用所设计的引物进行扩增反应，检测反应产物是否含有特异性 的梯状条带，以确定猪是否感染高致病性蓝耳病的快速检测技术。本专利技术的方法用于高致病性蓝耳病的检测具有如下优点1. 对靶基因的6个部位设定4种引物，利用链置换反应在恒温下使靶基因 高效扩增，由于其反应是由多个引物共同启动的，所以比RT-PCR更特异。2. RT-LAMP技术比现多采用的RT-PCR具有更高的灵敏度，但所需设备却 十分简单，仅需一台能提供6(TC左右的水浴锅即可，其试验成本可极大降低。3. RT-LAMP技术一般一个小时内即可完成，比RT-PCR节省时间。 一般情 况下RT-PCR检测需时要超过2个小时。本专利技术方法的具体步骤如下(1) 检测试样提取及核酸提取无菌取病猪血液、口拭子或粪便，或者死猪的器官组织，最好是猪的脑、 脾和肺等器官组织，用灭菌生理盐水研磨成乳悬液，并每毫升加入青、链霉素各 2 000IU,分装入小瓶贴好标签-80。C保存备用；分别按照试剂盒说明采用Trizol 方法或MiniBEST病毒RNA提取试剂盒，从血液、口拭子以及组织中提取包 括病毒基因在内的全基因组RNA;同时，无菌提取健康咽喉拭子中的RNA，以用作阴性对照。(2) 进行RT-LAMP反应RT-LAMP反应体系如下终浓度分别为2.0 的FIP禾B BIP引物，0.2 piM的F和B引物，1.0 mM dNTP， 8U的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)， lOxbuffer (containing 2 mM of MgS04, 0.8 M betaine ) and 1 pi提取的模 板cDNA，反应终体积为50W，反应在0.2ml PCR管中进行。RT-LAMP反应程序为恒温水浴锅63。C条件下反应45 min，然后在80°C 加热lOmin终止反应。RT-LAMP反应产物检测和结果判定反应产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳， 10V/cm， 30分钟后溴化乙啶染色后260nm波长观察。 附图说明图1为高致病性蓝耳病的RT-LAMP和RT-PCR检测方法的敏感性比较的电 泳图。图中(A)从左至右依次为M， DNA分子量标准DL-2000; 1泳道，阴 性对照;2-6泳道，不同拷贝数的模板进行的RT-PCR反应，分别为每管1、 10、 102、 103、 104和105拷贝。(B) 1-6泳道，RT-LAMP反应中每管中含有不同拷 贝数的模板，分别为每管l、 10、 102、 103、 104和105拷贝；7泳道，阴性对照。 由图可见，RT-PCR对高致病性蓝耳病的检出限为100拷贝，而RT-LAMP的检 出方法为10拷贝。 具体实施例方式本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
高致病性蓝耳病的检测方法，其特征是采集被检死猪的脑或肠内容物或肺或肾或肠或脾或肝或心组织，或者采集被检活猪的血液或口拭子或粪便，从所采样品中提取ＲＮＡ，以提取的ＲＮＡ为模板，以外侧上、下游引物和内侧上、下游引物进行ＲＴ－ＬＡＭＰ反应，ＲＴ－ＬＡＭＰ反应结束后取样进行琼脂糖凝胶电泳检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永生，陈豪泰，张杰，孙德惠，马丽娜，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]