一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法技术

本发明专利技术涉及一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1)腺苷标准溶液配制：称量腺苷标准品，用腺苷提取液溶解并定容，配制成腺苷标准溶液，备用；2)样品溶液配制：称取蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉样品，加入腺苷提取液溶解混匀，加入石英砂并研磨至糊状，冷却后转移至比色管中定容，用超声波振荡器超声振荡混合，在‑20℃环境下冷冻再融化并转移至离心机中离心处理，取上清液经0.45um滤膜过滤，制成样品溶液，备用；3)高效液相色谱法检测分析。本发明专利技术设计科学合理，腺苷的色谱峰分离效果好、流动相简单、腺苷回收率高且重复性好，具有操作简便省时、检测速度快及检测效率高等优点。

A rapid method for the determination of adenosine content in the mycelium of Paecilomyces moth

The present invention relates to a method for rapid detection of hepialid quasi adenosine content in mycelium of Penicillium, which is characterized in that the method comprises the following steps: 1) the preparation of standard solution: weigh the adenosine adenosine standard, adenosine extract dissolved and constant volume, preparation of adenosine standard solution, standby; 2) sample preparation: the Paecilomyces hepiali mycelium powder samples, adding adenosine extract dissolved and evenly mixed, quartz sand is added and grinding into paste, cooling after transfer to colorimetric tube sizing by ultrasonic oscillator ultrasonic mixing in 20 DEG C under the environment of freezing and melting and transferred to centrifuge centrifuge and the supernatant the 0.45um filter, into a sample solution, standby; 3) detection and analysis of high performance liquid chromatography. The design is scientific and reasonable, the chromatographic peak separation effect of adenosine is good, the mobile phase is simple, the adenosine recovery rate is high and the repeatability is good, and has the advantages of simple operation, time saving, fast detection speed and high detection efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法
本专利技术属于保健食品活性成分检测领域，涉及蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉活性成分的检测，特别涉及一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法。
技术介绍
冬虫夏草为麦角菌科的药用真菌，含有丰富的生理活性物质，具有独特的药用价值和广泛的药理作用，是中国特产的名贵中药材。近年来，人们从冬虫夏草真菌菌丝中分离出多种生物活性物质，主要有腺苷、虫草多糖、D-甘露醇、甾醇类等成分，这些主要成分具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等多种生理功能。目前，冬虫夏草的人工培育技术已较为成熟，根据培养方式的不同可分为固体栽培和液体发酵两种。与固体栽培相比，液体发酵具有周期短、工艺简单、不易污染、菌丝体产量大等优点。中国科学院微生物研究所和南开大学权威部门通过对天然冬虫夏草液体发酵方法培养得到蝙蝠蛾拟青霉蝙蝠蛾拟青霉菌丝体。研究显示蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中的腺苷等有效成分的含量与野生冬虫夏草相当，具有广阔的应用前景。腺苷又称腺嘌呤核苷，是人体循环疾病的药物。因为腺苷具有舒张血管、降低血压、减慢心率、抑制血小板等多种生理活性。腺苷是合成三磷酸腺苷(ATP)的主要原料，ATP已广泛应用于治疗心脑不全、脑动脉硬化及肌肉萎缩等症。腺苷已成为蝙蝠蛾拟青霉菌丝体发酵培养的重要指示性物质，因此，快速、有效的检测方法对于指导蝙蝠蛾拟青霉菌丝体发酵工艺研究具有重要的意义。按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中保健食品中腺苷的测定方法或《中国药典》(2010版)中金水宝胶囊中腺苷含量的测定方法是目前国内绝大多数工厂腺苷检测使用的方法。上述两种方法均采用直接超声的单一方式对腺苷进行提取，存在腺苷提取效率低的问题。并且，前者由于提取液为60％乙醇，极性较小，而蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷的极性相对较大，存在有效成分不能充分提取、腺苷含量测定不准确等问题，后者在进行液相色谱检测时，采用含2％四氢呋喃的磷酸盐缓冲溶液(0.066mol/L磷酸二氢钾：0.066mol/L磷酸氢二钠＝2：3)作为流动相，存在操作繁琐，流动相较为复杂，对仪器损耗大等问题，因此不能满足产品快速检验的要求。通过对公开专利文献的检索，并未发现与本专利申请相同的公开专利文献，本专利申请涉及的蝙蝠蛾拟青霉，是从天然的冬虫夏草中分离得到，经中国科学院微生物研究所鉴定，确定为蝙蝠蛾拟青霉。将蝙蝠蛾拟青霉通过液体发酵培养，经过滤、烘干后，得到本专利技术所用的菌丝体干粉。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测快速、准确，有效成分提取效率高且流动相损耗小的蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法。本专利技术解决其技术问题是通过以下技术方案实现的：一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1)腺苷标准溶液配制：称量腺苷标准品，用腺苷提取液溶解并定容，形成腺苷母液，用该腺苷母液配制成浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的腺苷标准溶液，备用；2)样品溶液配制：称取蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉样品0.5g，加入5mL腺苷提取液溶解混匀，加入50mg石英砂并研磨至糊状，冷却后转移至25mL比色管中并加腺苷提取液定容，用超声波振荡器超声振荡混合，在-20℃环境下冷冻再融化，反复冻融操作两次后冷却并转移至离心机中离心处理，取上清液经0.45um滤膜过滤，制成样品溶液，备用；3)高效液相色谱法检测分析：将上述腺苷标准溶液与样品溶液分别注入到液相色谱仪中进行液相色谱分析，以腺苷标准溶液的峰面积A为纵坐标，腺苷标准溶液浓度C为横坐标得到腺苷标准曲线A＝69117C+348.01，将相同时间内样品溶液的峰面积A’带入到腺苷标准曲线中，得到样品溶液中的腺苷含量C’，再根据样品溶液中腺苷含量计算得出蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉样品中的腺苷质量分数。而且，步骤3)中所述腺苷质量分数w采用如下公式进行计算：w＝(0.25C’/m)*100％其中：C’为样品溶液中的腺苷含量，单位为mg/mL；m为蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉样品的质量，单位为g。而且，所述的液相色谱条件为：色谱柱：WatersSymmetryC185μm4.6×150mm；流动相：有机相为甲醇，水相为超纯水；流速：1mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL；检测器采用紫外线检测器。而且，所述流动相的洗脱条件为单一流动相洗脱：甲醇：水＝10：90，洗脱时间12min。而且，所述紫外线检测器的检测波长为254nm。而且，所述步骤2)中腺苷提取液是质量分数为15％的甲醇溶液。而且，在步骤2)中超声振荡的参数为：温度65℃，频率45KHZ，功率100W，超声振荡时间1h。而且，所述步骤2)中离心机转速为3000r/min，离心5min。而且，所述的超纯水符合《GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法》中一级水的要求。本专利技术的优点和有益效果为：1、本专利技术的蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法，能够快速准确的检测并提取腺苷，液相色谱仪得到的腺苷色谱峰分离效果好，且提取检测时间缩短，提取效率高，可重复性强，回收价标率高。2、本专利技术选用质量分数为15％的乙醇作为腺苷提取液，可将腺苷从蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中充分提取分离，避免受杂质影响，提取检测精确高效。3、本专利技术的蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法，流动相组分简单，流动相的洗脱条件为单一流动相洗脱，流动相的损耗较小。4、本专利技术采取机械研磨法、超声提取法、反复冻融法三种方法结合，使蝙蝠蛾拟青霉细胞膜破裂，有利于腺苷从胞内释放出来，从而提高腺苷的提取效率。5、本专利技术设计科学合理，腺苷的色谱峰分离效果好、检测灵敏度高、流动相简单、腺苷回收率高且重复性好，具有操作简便省时、检测速度快及检测效率高等优点。附图说明图1为腺苷标准溶液的HPLC色谱图，峰1为腺苷(保留时间为8.716min)；图2为样品溶液的HPLC色谱图，峰1为腺苷；图3为腺苷标准曲线；图4为腺苷的线性回归曲线；图5为腺苷标品未经处理的HPLC色谱图，峰1为腺苷；图6为腺苷标准溶液经溶壁酶处理后的HPLC色谱图，峰2、3为反应产物；图7为腺苷标准溶液经蜗牛酶处理后的HPLC色谱图，峰1为腺苷，峰2为反应产物；图8为腺苷标准溶液经纤维素酶处理后的HPLC色谱图，峰1为腺苷，峰2为反应产物；图9为《保健食品检验与评价技术规范》检测方法的HPLC色谱图，峰1为腺；图10为《中国药典》(2010版)金水宝胶囊的测定方法的HPLC色谱图，峰1为腺苷；图11为本专利技术检测方法的HPLC色谱图，峰1为腺苷。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法，其创新之处在于：该方法包括如下步骤：1)腺苷标准溶液配制：称量腺苷标准品，用质量分数为15％的甲醇溶液溶解并定容，形成腺苷母液，用该腺苷母液配制成浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的腺苷标准溶液，备用；2)样品溶液配制：称取蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉样品0.5g，加入5mL质量分数为15％的甲醇溶液溶解混匀，加入50本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1)腺苷标准溶液配制：称量腺苷标准品，用腺苷提取液溶解并定容，形成腺苷母液，用该腺苷母液配制成浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的腺苷标准溶液，备用；2)样品溶液配制：称取蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉样品0.5g，加入5mL腺苷提取液溶解混匀，加入50mg石英砂并研磨至糊状，冷却后转移至25mL比色管中并加腺苷提取液定容，用超声波振荡器超声振荡混合，在‑20℃环境下冷冻再融化，反复冻融操作两次后冷却并转移至离心机中离心处理，取上清液经0.45um滤膜过滤，制成样品溶液，备用；3)高效液相色谱法检测分析：将上述腺苷标准溶液与样品溶液分别注入到液相色谱仪中进行液相色谱分析，以腺苷标准溶液的峰面积A为纵坐标，腺苷标准溶液浓度C为横坐标得到腺苷标准曲线A＝69117C+348.01，将相同时间内样品溶液的峰面积A’带入到腺苷标准曲线中，得到样品溶液中的腺苷含量C’，再根据样品溶液中腺苷含量计算得出蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉样品中的腺苷质量分数。

【技术特征摘要】
1.一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1)腺苷标准溶液配制：称量腺苷标准品，用腺苷提取液溶解并定容，形成腺苷母液，用该腺苷母液配制成浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的腺苷标准溶液，备用；2)样品溶液配制：称取蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉样品0.5g，加入5mL腺苷提取液溶解混匀，加入50mg石英砂并研磨至糊状，冷却后转移至25mL比色管中并加腺苷提取液定容，用超声波振荡器超声振荡混合，在-20℃环境下冷冻再融化，反复冻融操作两次后冷却并转移至离心机中离心处理，取上清液经0.45um滤膜过滤，制成样品溶液，备用；3)高效液相色谱法检测分析：将上述腺苷标准溶液与样品溶液分别注入到液相色谱仪中进行液相色谱分析，以腺苷标准溶液的峰面积A为纵坐标，腺苷标准溶液浓度C为横坐标得到腺苷标准曲线A＝69117C+348.01，将相同时间内样品溶液的峰面积A’带入到腺苷标准曲线中，得到样品溶液中的腺苷含量C’，再根据样品溶液中腺苷含量计算得出蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉样品中的腺苷质量分数。2.根据权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法，其特征在于：步骤3)中所述腺苷质量分数w采用如下公式进行计算：w＝(0.25C’/m)*100％其中：C’为样品溶液中的腺苷含量，单位为mg/mL；m为蝙蝠蛾拟青霉...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶松，郭晴，王祥河，王婷，曹琳琳，
申请(专利权)人：天津实发中科百奥工业生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12