一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法，它涉及一种真菌菌群结构的分析方法。它解决了目前黄檗丛枝菌根真菌菌群结构分析方法分析结果波动大、准确性差的问题。分析步骤：一、提取ＤＮＡ；二、Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ；三、变性梯度凝胶电泳；四、采用ＤＮＡ测序技术，即可分析出黄檗丛枝菌根真菌的菌群结构。本发明专利技术方法针丛枝菌根真菌遗传保守区１８Ｓ ｒＤＮＡ ＮＳ３１／Ｇｌｏ１进行检测分析，经过三次ＰＣＲ扩增黄檗丛枝菌根真菌ＤＮＡ的拷贝数高，可以获得大量的目标产物丛枝菌真菌１８Ｓ ｒＤＮＡ ＮＳ３１／Ｇｌｏ１区片段，便于步骤三进行变性梯度凝胶电泳；因此本发明专利技术方法具有准确性高，重复性好，稳定性高的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法。技术背景黄檗丛枝菌根真菌菌群可能由细凹无梗囊霉04. "ra6/c"/"to)、剌无梗囊 霉(丄w/"osa)、聚丛球囊霉(G. aggreg^wm)、悬钩子状球囊霉(G. n^/or附e)、 美丽盾巨孢囊霉(51. ca/os/ ora)、摩西球囊霉(G. mosseae)、幼套球囊霉 (G. Wwm.c^wm)、地表球囊霉(G. vera(/^附e)禾口透光球囊霉((？. d/ap/zam/m)等多种丛枝菌根真菌真菌组成，菌群结构复杂。现有的分析方法存在分析结果波 动大、准确性差的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决目前黄檗丛枝菌根真菌菌群结构分析方法分析 结果波动大、准确性差的问题，而提供的一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分 析方法。黄檗丛枝菌根真菌菌群结构按以下步骤进行分析 一、黄檗丛枝菌根和黄 檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA提取；二、 Nested-PCR扩增真菌18S rDNA NS31/Glol区进行三次PCR扩增；三、用步骤二第三次PCR扩增产物进行 变性梯度凝胶电泳采用变性聚丙烯酰胺凝胶，凝胶变性梯度范围30% 60%、 电泳电压130V、电泳时间8h、电泳温度为60。C;四、采用DNA测序技术， 即可分析出黄檗丛枝菌根真菌的菌群结构；其中步骤二中第一次PCR扩增的引物为GeoA2 : 5'-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3' 和 Geoll :5'-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3';第一次PCR扩增体系为20pL由2pL 含Mg2+10xPCR buffer、 1.6pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、2pL浓度为1.0拜ol/L 的Geoll、 2jxL浓度为1.0pmol/L GeoA2、 1U的Taq DNA聚合酶、2pL菌群 总DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第一次PCR扩增反应条件94。C预变性 4min， 94。C变性lmin、 54。C退火lmin、 72。C延伸2min， 30个循环，最后72。C延伸7min;步骤二中第二次PCR扩增以稀释100倍的第一次PCR扩增产物作为模板 DNA ， 第 二 次 PCR 扩增引物为 NS31-GC : 5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGG GCAAGTCTGGTGCC-3'和AMI: 5'画GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3';第二 次PCR扩增体系为20pL由2pL含Mg2+10xPCR buffer、 1.6joL浓度为2.5mmol/L 的dNTP、 2jiL浓度为1.0nmol/L的Geoll、 2pL浓度为1.0^mol/L GeoA2、 1U 的Taq DNA聚合酶、2^L模板DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第二次PCR 扩增反应条件94。C预变性2min， 94。C变性45s、 65。C退火lmin、 72°0延伸 45s， 30个循环，最后72t:延伸7min;步骤二中第三次PCR扩增以稀释100倍的第二次PCR扩增产物作为模板 DNA ， 第三次 PCR 扩增引物为 NS31-GC : 5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGG GCAAGTCTGGTGCC画3'和Glol: 5'-GCCTGCTTTAAACACTCTA画3';第三次 PCR扩增体系为20pL由2|iL含Mg2+10xPCR buffer、 L6^L浓度为2.5mmol/L 的dNTP、 2pL浓度为1.0jimol/L的Geo11、 2pL浓度为1.0pmol/L GeoA2、 1U 的Taq DNA聚合酶、2pL模板DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第三次PCR 扩增反应条件94。C预变性2min， 94。C变性45s、 55。C退火lmin、 72。C延伸 45s， 30个循环，最后72。C延伸7min;步骤三中的聚丙烯酰胺凝胶按质量百分比基本上由8%的丙烯酰胺制成。本专利技术方法针对丛枝菌根真菌遗传保守区18SrDNANS31/Glol进行检测 分析，经过三次PCR扩增黄檗丛枝菌根真菌DNA的拷贝数高，可以获得大量 的目标产物丛枝菌根真菌18S rDNA NS31/Glol区片段(丛枝菌根真菌18S rDNANS31/Gk)1区域片段大小为0.23kb，加上本专利技术设计的40bp的GC夹序 列为0.27kb)便于步骤三进行变性梯度凝胶电泳(DGGE);因此本专利技术方法 具有准确性高，重复性好，稳定性高的优点。附图说明图1是具体实施方式一步骤二Nested-PCR扩增产物的凝胶电泳图，图1 中"M"泳道标样为Marker, "1"泳道标样为黄檗丛枝菌根总DNA第一次PCR扩增产物，"2"泳道标样为黄檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA第一次 PCR扩增产物，"3"泳道标样为黄檗丛枝菌根总DNA第二次PCR扩增产物， "4"泳道标样为黄檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA第二次PCR扩增产物， "5"泳道标样为黄檗丛枝菌根总DNA第三次PCR扩增产物，"6"泳道标 样为黄檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA第三次PCR扩增产物；图2是具体实 施方式一步骤三变性梯度凝胶电泳图，图2中"1"泳道为黄檗丛枝菌根真菌 18S rDNA NS31/Glol区变性梯度凝胶电泳结果，图2中"2"泳道为黄檗根 际土壤丛枝菌根真菌18SrDNANS31/Glol区变性梯度凝胶电泳结果。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方 式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式黄檗丛枝菌根真菌菌群结构按以下步骤进行 分析 一、黄檗丛枝菌根和黄檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA提取；二、 Nested-PCR扩增真菌18S rDNA NS31/Glol区进行三次PCR扩增；三、用 步骤二第三次PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳采用变性聚丙烯酰胺凝 胶，凝胶变性梯度范围30% 60%、电泳电压130V、电泳时间8h、电泳温度 为6(TC;四、采用DNA测序技术，即可分析出黄檗丛枝菌根真菌的菌群结构；其中步骤二中第 一 次PCR扩增的引物为GeoA2 : 5'-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC画3' 和 Geoll :5'-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3';第一次PCR扩增体系为20pL由2^L 含Mg2+10xPCR buffer、 1.6pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、2jjL浓度为1.0fimol/L 的Geoll、 2pL浓度为1.0pmol/L GeoA2、 1U的Taq DNA聚合酶、2pL菌群 总DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第一次PCR扩增反应条件94t:预变性 4min， 94。C变性lmin、 54。C退火lmin、 72。C延伸2min， 30个循环，最后72 ""C延伸7min;步骤二中第二次PCR扩增以稀释100倍的第一次PCR扩增产物作为模板 DNA , 第 二 次 PCR扩增引物为 NS31-GC : 5'陽CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法，其特征在于黄檗丛枝菌根真菌菌群结构按以下步骤进行分析：一、黄檗丛枝菌根和黄檗根际土壤丛枝菌根真菌总ＤＮＡ提取；二、Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ扩增真菌１８Ｓ ｒＤＮＡ ＮＳ３１／Ｇｌｏ１区：进行三次ＰＣＲ扩增；三、用步骤二第三次ＰＣＲ扩增产物进行变性梯度凝胶电泳：采用变性聚丙烯酰胺凝胶，凝胶变性梯度范围３０％～６０％、电泳电压１３０Ｖ、电泳时间８ｈ、电泳温度为６０℃；四、采用ＤＮＡ测序技术，即可分析出黄檗丛枝菌根真菌的菌群结构； 其中步骤二中第一次ＰＣＲ扩增的引物为ＧｅｏＡ２：５′－ＣＣＡＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣ－３′和Ｇｅｏ１１：５′－ＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＡＣＴＴＣＣ－３′；第一次ＰＣＲ扩增体系为２０μＬ由２μＬ含Ｍｇ↑［２＋］１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、１．６μＬ浓度为２．５ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ、２μＬ浓度为１．０μｍｏｌ／Ｌ的Ｇｅｏ１１、２μＬ浓度为１．０μｍｏｌ／Ｌ ＧｅｏＡ２、１Ｕ的Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、２μＬ菌群总ＤＮＡ和余量的无菌双蒸馏水组成；第一次ＰＣＲ扩增反应条件：９４℃预变性４ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ、５４℃退火１ｍｉｎ、７２℃延伸２ｍｉｎ，３０个循环，最后７２℃延伸７ｍｉｎ； 步骤二中第二次ＰＣＲ扩增以稀释１００倍的第一次ＰＣＲ扩增产物作为模板ＤＮＡ，第二次ＰＣＲ扩增引物为ＮＳ３１－ＧＣ：５′－ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣ－３′和ＡＭ１：５′－ＧＴＴＴＣＣＣＧＴＡＡＧＧＣＧＣＣＧＡＡ－３′；第二次ＰＣＲ扩增体系为２０μＬ由２μＬ含Ｍｇ↑［２＋］１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、１．６μＬ浓度为２．５ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ、２μＬ浓度为１．０μｍｏｌ／Ｌ的Ｇｅｏ１１、２μＬ浓度为１．０μｍｏｌ／Ｌ ＧｅｏＡ２、１Ｕ的Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、２μＬ模板ＤＮＡ和余量的无菌双蒸馏水组成；第二次ＰＣＲ扩增反应条件：９４℃预变性２ｍｉｎ，９４℃变性４５ｓ、６５℃退火１ｍｉｎ、７２℃延伸４５ｓ，３０个循环，最后７２℃延伸７ｍｉｎ； 步骤二中第三次ＰＣＲ扩增以稀释１００倍的第二次ＰＣＲ扩增产物作为模板ＤＮＡ，第三次ＰＣＲ扩增引物为ＮＳ３１－ＧＣ：５′－ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＴＧ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡柏岩，接伟光，葛菁萍，王雪，阎秀峰，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]
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