杂草稻红色果皮基因的分子标记制造技术

本发明专利技术涉及杂草稻红色果皮基因的分子标记方法，属于分子遗传学领域。利用水稻品种０２４２８（白色果皮）与扬中杂草稻（红色果皮）杂交，明确扬中杂草稻红色果皮基因是显性单基因，由母体基因型决定，正反交结果表明无细胞质效应。根据已克隆的普通野生稻的红色果皮基因Ｒｃ的基因结构设计了ＩｎＤｅｌ标记ＲＩＤ１４，该ＩｎＤｅｌ标记与杂草稻红色果皮基因的共分离。利用该标记可以准确有效地从栽培稻中鉴别出红米杂草稻及其衍生系，可以为杂草稻的鉴别提供分子依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了杂草稻红色果皮的分子标记鉴定方法，属于分子遗传学领域，专用 于杂草稻的红色果皮基因型的分子鉴定。
技术介绍
水稻亚洲栽培稻(Or;;za^^vaL.)是世界上最重要的粮食作物之一，为世界上近 一半的人口提供粮食。但是，现在水稻的生产受到越来越严重的杂草危害，尤其是与 它同属于一个生物物种的杂草稻(Oyza s油Va L. f spontaneous)。杂草稻是广泛分布在世 界各地稻田中的一种恶性杂草，能降低水稻的产量和质量。因其果皮常为红色，杂草 稻也被称为红米稻(Red rice)。由于杂草稻与栽培稻的亲缘关系很近，杂草稻比稻田中 的其它杂草更难防除。由于水资源和农村劳动力的缺乏，包括中国在内的许多国家的水稻栽培方式都正 在从传统的移栽方式向省水省劳动力的直播方式转变，杂草的管理方式从精细向粗放 转变，这些耕作方式和管理方式的改变为杂草稻的生长和扩散提供了有利的条件。因 此，近年来，杂草稻给世界各地的水稻生产造成了越来越严重的影响，在中国东北和江 苏地区也频繁的发现杂草稻，并迅速扩散，治理杂草稻成为刻不容缓的事情。杂草稻是直播稻田水稻生产主要危害因素，在苗期其形态特征与栽培稻完全一致， 难以早期发现，杂草稻生命力旺盛，分蘖力强，与栽培稻竟争营养，多数抽穗早，落 粒性强，对水稻生产造成危害，同时少量的杂草稻种子混入栽培稻， 一方面影响稻米 外观品质，另一方面可以随种子运输，加剧杂草稻的流行和泛滥，给水稻生产造成更 为严重的危害。因此，急需建立可以对杂草稻基因型进行鉴定的技术体系， 一方面对 直播稻田中杂草稻进行早期鉴定，另一方面可以对杂草稻危害的预测预报提供依据。世界各国发现的杂草稻决大多数是红色果皮，红色果皮是杂草稻的基本特征之一， 而决大多数栽培稻是白色果皮，因此杂草稻区别于栽培稻的重要特征是果皮颜色，而 果皮颜色只有在种子成熟以后才能观察到，为此本研究开发了可以对果皮颜色进行基 因型鉴定的共显性分子标记，为建立杂草稻鉴定的技术体系奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供江淮流域杂草稻鉴别的分子标记方法，利用本研究开发的基于PCR的实用经济型标记，可以有效地从栽培稻中鉴定出红米杂草稻，为杂草稻的 鉴别提供分子证据。本专利技术所提供的可鉴别杂草稻和栽培稻的InDel标记RIDM，是通过以下方法获得的1)在江苏收集到目前在水稻直播稻田危害生产的杂草稻，其颖壳为草黄色，其 果皮为红色，也称为"红米稻"。将收集到材料与广亲和粳稻品种02428配组正反交杂 交组合F,。杂草稻作母本，其杂种的果皮颜色为红色，以02428作母本，其杂种果皮 颜色为白色，收获正反交R所结F2种子果皮颜色都为红色，R所结F3种子果皮颜色分 离，红色果皮白色果皮分离比例符合3: 1，说明控制杂草稻红色果皮基因为显性单 基因控制，并由母体基因型决定。2 )普通野生稻(ft巧/7"收0/2 L.)是栽培稻(。.M〃ra L.)的祖先，普通野生 稻的果皮为红色，控制其果皮颜色的基因化已经克隆(2006, Plant Cell)。化编码 b-HLH型转录因子，正调控原花色素(Proanthocyanidin)的合成，其等位基因rc在 第6外显子存在14bp的缺失，导致翻译提前终止。我们根据这14bp缺失设计了 InDel 标记，InDel标记RID14引物序列如下 上游引物5'TCCAGGCACCACACAGAGA 3' 下游引物5'GGCACTGAAATCACCTTGG 3'对普通野生稻(红色果皮)的基因组DNA扩增产物为154bp,而栽培稻(白色果皮) 的基因组DNA扩增产物为140bp。通过对杂草稻PCR产物测序证实，控制杂草稻的红色果皮基因与普通野生稻一致。3 )利用SDS方法提取02428与杂草稻的F2群体各单株的DNA,利用InDel标记 RID14引物进行PCR,扩增产物在8%聚丙烯酰胺进行电泳或者3.5%的琼脂糖电泳分 析，我们发现该标记与红色果皮共分离。即该标记是共显性标记，能对果皮颜色的纯 合基因型和杂合基因型进行准确鉴定，标记基因型为RcRc, Rcrc的单珠，其果皮颜色 为红色，标记基因型为rcrc的单珠，其果皮颜色为白色。标记基因型RcRc: Rcrc: rcrc 符合l: 2: 1的比例(图1)。4)利用该标记对江淮流域杂草稻以及近年来收集到的危害江苏水稻生产的杂草稻 共24份材料(红色果皮)扩增出154bp片段，而所有白色果皮扩增出140bp片段，说 明该标记可以准确鉴定红色和白色果皮基因型(图2)。扩增杂草稻丽A,能够扩出154bp的扩增片段，而栽培稻扩增出140bp片段。由 于该标记是基于果皮颜色控制基因/ c而设计的共显性分子标记，可进行基因型鉴定， 即可以对果皮颜色基因的纯合基因型和杂合基因型进行鉴别。本研究所提供的鉴别杂草稻的分子标记方法，具有如下优点通过本专利技术分子标记在国际上首次获得了对杂草稻和栽培稻进行果皮颜色基因型 鉴别的共显性分子标记。本专利技术的分子标记可以从栽培稻中鉴别出杂草稻，准确可靠，鉴定方便。杂草稻 的基本特征之一是红色果皮，通过分子标记检测可以判断栽培稻中是否有杂草稻或者 有杂草稻趋向的栽培稻。该标记检测快速经济而有效，不受环境影响。利用该标记对 在江淮流域所收集到的杂草稻和栽培稻能准确地鉴定和区分。附图说明图l引物RID14对"W16/02428"F2群体扩增PAGE胶结果；(P1为杂草稻W16, P2为02428， F,为杂种，l-44为F2群体的部分单株)图2引物RID14对48份材料PAGE胶结果，杂草稻、普通野生稻、Dular、 Kasalath 为红色果皮，带型一致，而其余19份白色果皮材料带型一致；(M为DNA ladder; a 为200bp; b为150bp; c为100bp;杂草稻24份1-24道；普通野生稻3份43-45 道；Dular: 30道；Kasalath: 42道；)具体实施方法下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 实施例l、 一种鉴别杂草稻的分子标记的获得 1供试材料利用从江苏扬中收集到杂草稻W16与粳型广亲和品种02428,以及其杂种F,、 F2 群体。2果皮颜色鉴定随机取材料成熟种子IO粒，用出糙机将种子外壳脱去或直接用手剥去外壳，查看 种子果皮颜色。3红色果皮遗传分析群体2005年利用从扬中收集到的红色果皮杂草稻，编号为W16,与白色果皮广亲和粳稻品种02428配制正反交杂交种F,， 2006年种植F,并收获F2种子，2007年种植F2群 体200株，并在分蘖期取叶片以提取DNA,并收获&种子。当W16作母本时，杂种 F,种子果皮颜色为红色；02428做母本时，杂种F！种子果皮颜色为白色，F2种子果皮 颜色都是红色，F3种子果皮颜色出现红色和白色的分离，说明红色果皮受核基因控制， 与细胞质无关。由于果皮是由胚囊发育形成的，由母本基因型决定。F3种子果皮颜色 由F2基因型决定，红色果皮与白色果皮的比例符合3: 1，说明杂草稻的红色果皮对白 色果皮是由单基因控制的显性性状。 4 DNA提取在水稻分蘖期或孕穗期取l克左右水稻叶片，利用SDS方法提取DNA。 DNA提取参照Dellapporta等()的方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
鉴别杂草稻红色果皮基因的分子标记方法，其特征在于：　开发了可以准确鉴别杂草稻果皮颜色基因型的共显性ＩｎＤｅｌ标记ＲＩＤ１４　上游引物：５′ＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＡＧＡＧＡ　３′　下游引物：５′ＧＧＣＡＣＴＧＡＡＡＴＣＡＣＣＴＴＧＧ　３′　扩增杂草稻ＤＮＡ，能够扩出１５４ｂｐ的扩增片段，而栽培稻扩增出１４０ｂｐ片段。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨杰，仲维功，陈志德，王军，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]