本发明专利技术涉及一种核酸蛋白双探针ＳＰＲ生物传感ＤＮＡ甲基化检测方法。本发明专利技术以ＳＰＲ芯片表面包被的核酸探针特异性识别待测样本中靶基因启动子区核酸序列，继而以ＭＢＤ识别其中含有甲基化的部分，芯片表面形成核酸探针－甲基化靶核酸－ＭＢＤ蛋白复合物，通过ＳＰＲ角的变化，实现ＤＮＡ甲基化的定量检测。本发明专利技术解决了现有的甲基化检测方法普遍存在着的检测稳定性差和准确性差的缺陷。本发明专利技术开创性的将特异性核酸探针杂交和甲基化ＣｐＧ结合蛋白的甲基化ＣｐＧ结合功能域（ＭＢＤ）特异结合甲基化ＤＮＡ的特性，借助ＳＰＲ检测技术平台，建立了核酸蛋白双探针ＳＰＲ生物传感ＤＮＡ甲基化检测方法。具有分析速度快、灵敏度高，能检测微量靶ＤＮＡ甲基化，可同时进行多基因甲基化的联合检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种DNA甲基化的检测方法，特别是一种核酸蛋白双探针SPR生物传感 DNA甲基化;险测方法。
技术介绍
DNA曱基化是指由曱基转移酶介导，在胞嘧啶5位碳原子上加入一个曱基基团，使 之变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学反应。DNA曱基化在基因表达调控、发育调节、基 因组印迹等方面发挥重要作用，是表观遗传学研究的热点。基因组正常甲基化模式改变 与肿瘤和某些遗传病的发生密切相关。检测DNA曱基化不仅可以用于各种疾病发生发展 机理的研究，同时对于相关疾病的诊断、疗效观察及预后判断，具有重要的价值。肿瘤 细胞常存在抑癌基因启动子部位的CpG岛曱基化率增高，曱基化所导致的抑癌基因失活 是肿瘤发生的重要原因。由于DNA曱基化异常在早期癌、甚至癌前病变中即已出现，因 此抑癌基因曱基化已成为肿瘤早期检测中十分重要的分子指标。DNA曱基化的检测方法，根据研究目的可分为基因組整体水平的曱基化检测和特 异位点曱基化的检测两种。根据研究方法可以分为两大类1)亚硫酸氢盐化学修饰法。 该法是基于亚硫酸氢钠可将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，而对曱基化胞嘧啶不起作用 的原理。其可进一步分为5种常用方法，即亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)、甲基化特异性PCR (MSP)、曱基化特异性荧光定量PCR (荧光定量MSP )、曱基化敏感的单核苷酸引物扩增 (MS-SnuPE)和曱基化特异性微阵歹'(MSO)技术。2)非亚硫酸氢盐法。主要包括，①将 DNA裂解为碱基，通过色语柱分离后，经紫外光测定其吸收峰并定量的高效液相色谱 (HPLC)法；②利用DNA曱基化敏感的限制性内切酶Hpal I和不敏感的同裂酶Msp I消 化DNA的限制性内切酶法；③利用特异性的单克隆抗体与曱基化的胞嘧咬之间的抗原抗 体反应的免疫学方法等。亚硫酸氢盐法主要用于特异位点曱基化的检测；而非亚硫酸氢 盐法主要用于基因组整体水平的曱基化分析，其无法对甲基化CpG进行定位。现有的曱基化检测方法普遍存在检测稳定性和准确性差的缺陷。亚硫酸氢盐法存在 C —U不完全，极少数5-mC转化为T;高达90%的DNA被降解，灵敏度低；化学修饰耗 时长，以及PCR扩增的固有缺陷等诸多问题。高效液相色谱法操作繁瑣，技术要求高， 主要用于科学研究；限制性内切酶法仅用于检测内切酶识别位点处的曱基化状态，且易 因为不完全消化导致假阳性的结果；而免疫学方法只能在甲基化的胞嘧啶处于非石威基对 状态下进行检测。因此，这些方法难以为临床和科研所广泛接受。运用高灵敏度的检测 平台，建立新型的DNA曱基化检测技术，是目前迫切需要解决的重大问题。表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)现象是发生在约50纳米厚的金 膜表面的一种光学现象。当入射光以大于临界角照射到金膜表面时，金膜M面固定的 生物大分子会在入射光照射的作用下产生沿金膜表面传播的表面等离子波。改变入射光 至一特定的角度，可导致光波与金膜产生共振，入射光的光能被吸收，此时的入射光角 度称为SPR角。SPR角随着金膜表面介质折射率的变化而变化，而介质折射率的变化又 与结合在金膜表面的生物分子质量成正比。因此，通过记录在生物反应过程中SPR角度 的变化，可以反映出生物大分子间的相互作用。SPR生物传感器具有高灵敏和实时响应 的特性，是一种有广泛应用前景的研究生物分子间相互作用及定量检测的新兴技术。基于SPR能高度灵敏的检测多种生物分子的相互作用的特性；专利技术人首先将特异性 核酸探针杂交和甲基化CpG结合蛋白的曱基化CpG结合功能域(MBD)特异结合曱基化DNA的特性，借助SPR检测技术平台，建立了核酸蛋白双探针SPR生物传感DNA曱基化 检测方法。本方法的建立，开创了DNA曱基化检测新的
，将使曱基化检测在临 床诊疗和生命科学研究中得到广泛应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术缺陷，提供一种核酸蛋白双探针SPR生物传感 DNA曱基化检测方法。 本专利技术的技术方案是核酸蛋白双探针SPR生物传感DNA曱基化检测方法，其主要技术特征在于以SPR芯 片表面包被的核酸探针特异性识别待测样本中靶基因启动子区核酸序列，继而以MBD 识别其中含有曱基化的部分，芯片表面形成核酸探针-曱基化把核酸-MBD蛋白复合 物，通过SPR角的变化，实现DNA甲基化的定量检测；具体步骤如下，(1) 制备曱基化阳性标准品；(2) 取体液或组织细胞样本，采用磁珠法微量核酸提取技术提取待测样本DNA和甲 基化阳性标准品DNA;(3) 制备带生物素标记的核酸探针，以带生物素标记的核酸探针包被于覆盖有亲和素 的芯片表面；(4) 按从低浓度到高浓度的顺序，依次将甲基化阳性的标准品进样，继而通入经修饰 的MBD,根据SPR曲线的变化，分别计算不同浓度的曱基化标准品所对应的SPR 角的差值，获得标准曲线；(5) 对芯片进行再生，进待测样本DNA,继而通入MBD;根据SPR角的变化，对照 标准曲线，对待测样本中的甲基化靶基因进行定量。本专利技术开创性的将特异性核酸探针杂交和曱基化CpG结合蛋白的曱基化CpG结合功 能域(MBD)特异结合曱基化DNA的特性，借助SPR检测技术平台，建立了核酸蛋白双 探针SPR生物传感DNA曱基化检测方法。本方法的应用范围十分广阔，既可以检测体液 (如血液、尿液及胸腹水等)中游离的DNA曱基化，也能检测组织细胞(含活检组织和 脱落细胞等)内的DNA曱基化。本方法的建立，将有助于进一步推动DNA曱基化检测 在临床诊疗中的应用，促进生命科学中DNA曱基化相关领域的研究。本专利技术的优点和效果在于，利用SPR生物传感检测DNA曱基化，分析速度快；检测的 灵敏度高，食^检测微量耙DNA甲基化；SPR并联有多个通道，可同时进行多基因曱基化 的联合4企测。本专利技术的其它优点和效果将在具体实施过程中继续详细描述。 附图说明图1——核酸蛋白双探针SPR生物传感DNA曱基化检测方法原理示意图。 其中，a—一偏振光照射覆盖有亲和素的SPR传感芯片； b—一核酸探针特异性识别待测样本中耙基因启动子区核酸片段； c一一MBD识别曱基化的核酸。 图2—一SPR多通道联合检测示意图 具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作出详细说明1、 检测对象血浆中抑癌基因APC、 RASSF、 P16和MGMT的曱基化。2、 具体步骤1)制作标准曲线(1)分别PCR扩增含APC、 RASSF、 P16和MGMT基因启动子的核酸片段，纯化DNA,紫 外分光光度计法进行核酸定量，用于制备曱基化标准品；由于血浆中DNA的平均长度为2. lkb，因而通过引物设计使PCR产物的长度均接近2.lkb;扩增APC的PCR引物上游引物Pl: 5'-TGCACCACTGCACTCGCCTG-3' 下游引物P2: 5'-TTCTGCTGTTCAGGCTGCAT-3' APC扩增产物(1894bp):AGAA-3'扩增RASSF的PCR引物上游引物P3: 5'-CTCAGGTGACACACCAGCTA-3' 下游引物P4: 5'- AGCCTGGGAAGATGGACTCC -3' RASSF扩增产物(2037 bp):CCTTGGCCCTTCTTGAG嵐GGGTTTGTG本文档来自技高网...
【技术保护点】
核酸蛋白双探针ＳＰＲ生物传感ＤＮＡ甲基化检测方法，其特征在于以ＳＰＲ芯片表面包被的核酸探针特异性识别待测样本中靶基因启动子区核酸序列，继而以ＭＢＤ识别其中含有甲基化的部分，芯片表面形成核酸探针－甲基化靶核酸－ＭＢＤ蛋白复合物，通过ＳＰＲ角的变化，实现ＤＮＡ甲基化的定量检测；具体步骤如下， （１）制备甲基化阳性标准品； （２）采用磁珠法微量核酸提取技术，提取待测体液或组织细胞样本ＤＮＡ和甲基化阳性标准品ＤＮＡ； （３）制备带生物素标记的核酸探针，并包被于覆盖有亲和素的芯片表面； （４）按从低浓度到高浓度的顺序，依次将甲基化阳性的标准品进样，继而通入经修饰的ＭＢＤ，根据ＳＰＲ曲线的变化，分别计算不同浓度的甲基化标准品所对应的ＳＰＲ角的差值，获得标准曲线； （５）对芯片进行再生，进待测样本ＤＮＡ，继而通入ＭＢＤ；根据ＳＰＲ角的变化，依标准曲线计算待测样本中甲基化靶基因的含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘世扬，徐建，束永前，张石江，张寄南，王芳，陈丹，黄珮珺，杨笛，
申请(专利权)人：潘世扬，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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