农作物甲基化差异ＤＮＡ标记连锁图谱的构建方法及其应用技术

一种农作物甲基化差异ＤＮＡ标记连锁图谱的构建方法及其应用，目的是具有更直接与基因表达相关优势并应用于农作物辅助育种。本发明专利技术首先获得甲基化特异性ＤＮＡ片断，然后根据甲基化差异片段在杂交亲本之间的异同及其在杂交、回交等后代群体中的分离状况，确定这些片段之间以及目的性状与这些分离片段之间的连锁强度；寻找与目标性状紧密连锁的甲基化差异ＤＮＡ分子标记，从而构建该时期甲基化敏感的分子标记连锁图谱，这一方法可用于育种中辅助对优良性状的选择。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种构建植物分子标记连锁图谱的新方法，特别是一种利用甲基化差异的 DNA片段作为分子标记构建连锁图谱的方法，以及其应用于农作物辅助育种。
技术介绍
DNA甲基化是活体细胞中最常见的一种DNA共价修饰现象，是在甲基转移酶(甲基化 酶)催化下将S-腺苷-甲硫氨酸上的甲基连接到DNA分子腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)碱基 上，进行DNA修饰的过程。在大多数真核生物的细胞中，90%以上的甲基化作用都是发生 在DNA的CpG双碱基序列处，而且这些序列大部分被对称地甲基化；在高等植物中，多数 DNA甲基化发生在CpG 二核苷酸对中的胞嘧啶5-碳原子上，但甲基化也常发生在CAG、 CTG 三核苷酸中和CCG基元中，常常是对称发生的，也有非对称序列甲基化的报道。DNA的甲 基化是生物体中的表观遗传现象，即在发育过程中，虽然基因表达调控发生改变，但核苷 酸序列没有变化，它可以遗传，也可能发生逆转(脱甲基化)。在高等植物中，DNA携带 着两种形式的信息，即由核苷酸序列决定的遗传信息和由它的结构决定的外遗传信息。外 遗传信息是不处于DNA自身的核苷酸序列中的可影响DNA活性的任何可遗传的物质，能够 控制基因的表达。DNA甲基化并不改变基因的碱基序列而是通过基因的表达以改变吝功能。 大量研究表明，DNA甲基化不仅可以遗传，而且存在特定的动态变化模式。DNA甲基化是调 节植物基因的一种表达方式，在基因表达调控中扮演了很重要的角色。DNA的甲基化修饰 参与基因表达调控，胚胎发育、细胞分化、基因组印迹、X染色体失活和细胞记忆等诸多 生物学过程，DNA发生甲基化可以关闭某些基因的活性，去甲基化后又可以重新诱导基因 的活化表达，在植物转基因的研究中，发现几乎所有的转基因沉默现象均与转基因及其启 动子的甲基化有关，目前的研究认为发生在转基因启动子5'端的甲基化是造成转录水平 基因沉默的主要原因。不同生育期的植物以及植物的不同器官，由于基因表达模式的不同，会导致基因组总 甲基化水平发生变化。而且不同植物在生长发育过程中甲基化水平变化的趋势不同，不同 器官间甲基化水平也有差异。基因甲基化模式的改变可以影响植物的花期、育性、花及叶 片的形态等。找到控制不同器官甲基化差异表达的基因，可以研究其在植物生长发育过程 中的特定时空表达和调控；对DNA甲基化水平进行研究，发现许多植物在杂交种中一些 位点与亲本相比表现为去甲基化，而另一些位点表现为甲基化水平增加，表明在杂交种中 DNA甲基化水平的改变，导致新的基因调控系统的形成，通过与杂种优势性状的相关性分 析，可进一步研究杂种优势产生的分子基础，有利于在早代就选出能产生杂种优势的亲本。DNA甲基化分子标记是DNA甲基化水平遗传变异的直接反映，为研究植物整个基因组 甲基化水平的变化，利用甲基化差异的DNA片段作为分子标记构建连锁图谱很有意义。
技术实现思路
本专利技术目的是克服上述已有技术的不足，提供一种具有更直接与基因表达相关优势的 农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱构建方法，并应用于农作物辅助育种。从理论上讲，根据植物不同生育期DNA甲基化的差异，可以构建不同发育时期的DNA 甲基化图谱，但通过长期的育种实践工作可以发现，在植物整个基因组中发生DNA甲基化 的敏感部位应该大体上是一致的，或者至少范围不会有太大变化，只是在不同时期，敏感 部位发生甲基化或去甲基化存在着差异。本专利技术首先获得甲基化特异性DNA片断，然后根据甲基化差异片段在杂交亲本之间的 异同及其在杂交、回交等后代群体中的分离状况，确定这些片段之间以及目的性状与这些 分离片段之间的连锁强度。寻找与目标性状紧密连锁的甲基化差异DNA分子标记，从而构 建该时期甲基化敏感的分子标记连锁图谱。本专利技术采用限制性内切酶一PCR方法获得甲基 化差异片段。为了能够检测到尽可能多的某一发育阶段生物体基因组甲基化位点，必须将DNA基因 组完全消化，从而得到完全消化的DNA甲基化差异片段，用于构建DNA甲基化的分子标记 连锁图谱。DNA甲基化差异分子标记连锁图谱既可以利用已有DNA分子标记连锁图及其上 的标记作为锚定标记，确定已有图谱上的标记与DNA甲基化差异标记间的距离，也可以全 部采用DNA甲基化差异多态性标记单独构建。本专利技术将SSR标记作为锚定标记，由于其标记相对较少，只构建出高粱部分染色体连 锁群，与未构建的高粱染色体连锁群相连锁的甲基化标记会单独构成连锁群，尽管目前无 法确定它们与哪条染色体连锁，但随着SSR标记数目的增加，它们会被定位到相应的染色 体上。选择较多的锚定引物和甲基化标记引物，在材料亲本间进行基因组多态性检测，获 得较多的多态性标记，可以对甲基化遗传连锁图谱进行加密和完善。本专利技术农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱的构建方法，是采用限制性内切酶一PCR 方法获得甲基化差异片段，酶切和连接可同时进行，或者分别进行；PCR扩增方法，可采 用预扩增和选择性扩增两步完成，或者一步扩增完成。本专利技术农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱构建方法的应用，是利用甲基化片段的差 异，构建分子标记的连锁图谱，应用于育种工作中辅助对优良性状的选择，应用于与甲基 化相关的功能基因的分析克隆；应用于分析与作物杂种优势相关的甲基化标记，并进一步 研究作物杂种优势产生的分子机理；可以找到控制不同器官甲基化差异表达的基因，进一步研究其在植物生长发育过程中特定时空表达和调控；可以找到甲基化热点区域，分析植 物不同生长发育阶段的甲基化模式，研究生物体表观遗传性状;还可分析转基因作物目的 基因表达沉默的原因。本专利技术所使用的实验材料是高粱。选取高粱品种中强优势组合B2V4 X 1383-2，建立其 Fi群体及衍生的F2群体。实验用高粱材料播种于山西省农业科学院高粱所实验田，出苗 后约五周取上部叶子，采用PEX方法提取亲本B2V4 、 1383-2、 F,及衍生的&群体120株 单株的DNA，测定它们的浓度和纯度，稀释到400 ng/ul待用；用^boR I/处al1和1/#印1两种酶切组合分别对以上高粱材料的DNA基因组进行限制性消化，酶切作为整 个专利技术的第一步，其完成情况直接决定以后的各步实验和结果，酶切和连接同时进行，37 'C反应8-10小时；根据接头和酶切位点核心序列设计预扩增引物，对以上高粱材料DNA 基因组的酶切连接片断进行预扩增；在预扩增引物3'端加l-3个选择性碱基作为选择扩 增引物，在高粱亲本间进行基因组多态性检测，选用多态性引物，对高粱亲本B2V4 、 1383-2 、杂交种F,及衍生的F2群体中120株高粱材料的预扩增产物进行选择性扩增；聚 丙烯酰胺凝胶电泳，1%硝酸银染色，胶干后进行带型统计分析；本实验中，以SSR标记作 为锚定标记，高粱10个连锁群上分别随机选取至少10对引物，SSR引物序列从 http:〃sorgblast2.tamu.edu获得，由上海生工生物工程公司合成。本实验中选取129对Xtxp 系列的高粱SSR引物，运用作图软件，构建高粱的SSR分子标记连锁图谱，以SSR标记 作为锚定标记，确定现有SSR图谱上的标记与DNA甲基化差异标记间的距离，构建高粱甲 基化差异DNA标记的连锁图谱，本专利技术方法同样可用于构建其他作物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种农作物甲基化差异ＤＮＡ标记连锁图谱的构建方法，其特征是首先获得甲基化特异性ＤＮＡ片断，然后根据甲基化差异片段在杂交亲本之间的异同及其在杂交、回交等后代群体中的分离状况，确定这些片段之间以及目的性状与这些分离片段之间的连锁强度；寻找与目标性状紧密连锁的甲基化差异ＤＮＡ分子标记，从而构建该时期甲基化敏感的分子标记连锁图谱。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙毅，段永红，梁小红，钱锦，仪治本，闫敏，
申请(专利权)人：山西省农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：14[]