本发明专利技术属于分子生物学的领域，具体是一种用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒及其使用方法，实现了口腔磷状上皮细胞癌组织的早期检测及判别。用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒，由以下试剂组成：ＴＲＩＺＯＬ、氯仿、异丙醇、乙醇、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）↓［１５］、试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ－ａ、试剂Ⅲ－ｂ、试剂Ⅲ－ｃ和试剂Ⅲ－ｄ。其使用方法：样本的制备和贮存；各基因的ＲＴ－ＰＣＲ操作和琼脂糖凝胶电泳；对琼脂糖凝胶电泳结果进行定量分析，判定组织是否为口腔磷状上皮细胞癌组织。本发明专利技术具有如下有益效果：可在同一反应中进行四个基因的ＲＴ－ＰＣＲ反应，并可同时进行多个组织样本是否为ＯＳＣＣ的判定；判定时间短，准确性高；对于准确检测ＯＳＣＣ、及时阻断ＯＳＣＣ的发展、预防ＯＳＣＣ的转移等具有重要的现实意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学的领域，具体涉及一种用于口腔磷状上皮细胞癌组织(Oralsquamous cell carcinomas，OSCC)的检测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
口腔鳞状上皮细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是人类最常见肿瘤之一，也是发展中国家重要的健康问题之一。口腔癌好发于中老年人，且发病率随年龄的增长而增长，但近年来也有年轻化的趋势，90％的口腔癌为OSCC。口腔粘膜癌前病变是一种已有形态学上改变的组织，它与外观相应正常的口腔粘膜相比较具有更大的癌变可能。口腔粘膜癌前病变现已知的有口腔白斑(oral leukoplakia)，口腔红斑(oral erythroplakia，OEP)，口腔扁平苔藓(oral lichenplanus，OLP)，口腔粘膜下纤维化(oral submucous fibrosis，OSF)，上皮异常增生等。 在我国，OSCC的发病率有上升趋势，白斑、扁平苔藓等癌前病变的癌变率相当高。目前，OSCC的五年生存率为30％，这与30年前相比并没有明显增高。60％的口腔癌被发现时已是晚期。OSCC直到晚期才能被确诊和治疗是口腔癌的诊断率和存活率不能提高的主要原因。降低OSCC死亡率的关键是预防和早期诊断。如能在早期对OSCC进行诊断和治疗，其五年生存率可达80％。OSCC的早期检测及判别癌前病变是否已经转变为OSCC对提高病人生存率有重要意义。口腔内的异常增生和病变越早被准确判别为OSCC并得到及时的诊治，患者存活的几率就越大。
技术实现思路
本专利技术为了实现口腔磷状上皮细胞癌组织的早期检测及判别，提供了。 本专利技术采用如下的技术方案实现 一种用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒，其特征在于由以下试剂组成TRIZOL、氯仿、异丙醇、乙醇、Oligo(dT)15、试剂I、试剂II、试剂III-a、试剂III-b、试剂III-c和试剂III-d。 其中，试剂I由MgCl2、Tris-HCL+KCL、RNase Free dH2O、dNTP Mixture、RNase Ihibitor、AMV Reverse Transcriptase XL组成； 试剂II由Tris-HCL+KCL、灭菌蒸馏水、TaKaRa EX Taq HS组成； 试剂III-a为基因GDF-15的PCR引物，试剂III-b为基因BCL-2的PCR引物，试剂III-c为基因CTNNB-1的PCR引物，试剂III-d为基因β-actin的PCR引物。 上述各试剂的配比如下表1～表4所述表1试剂盒的组成 注本表所列试剂的量为10个样本反应 表2试剂I的组份 表3试剂II的组份 表4试剂III的组份 所述的用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒的使用方法，其特征在于步骤如下 1)、样本的制备和贮存； 2)、同时进行GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的RT-PCR操作； 3)、GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的琼脂糖凝胶电泳； 4)、使用Kodak Digital Science1D软件对琼脂糖凝胶电泳结果进行定量分析，将GDF-15、BCL-2和CTNNB-1的相对表达量带入方程“组织性质判定值P＝-16.099+0.044XGDF-15-0.082XBCL-2+0.234XCTNNB-1”计算组织性质判定值P； 5)、组织的判定值P与0比较判定该组织是否为口腔磷状上皮细胞癌组织，大于0为非口腔磷状上皮细胞癌组织，小于0为口腔磷状上皮细胞癌组织。 所述的GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的RT-PCR操作的退火温度为54℃。 本专利技术具有如下有益效果使用本试剂盒提供的试剂和使用方法可在同一反应中进行GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin四个基因的RT-PCR反应，并可同时进行多个组织样本是否为口腔磷状上皮细胞癌组织的判定；判定时间短，准确性高；对于准确检测OSCC、及时阻断OSCC的发展、预防OSCC的转移等具有重要的现实意义。 附图说明 图1使用本专利技术方法获得的12例组织RT-PCR电泳图。 图中泳道1、6、7、10、11、15、16、20均为DNA分子量标准，本实例中使用的是DL-2000；泳道2、3、4、5、14、19为口腔磷状上皮细胞癌组织，共6例不同病例的组织；泳道8、9、12、13、16、18为非口腔磷状上皮细胞癌组织，共6例不同病例的组织；bp为base pair的简写，即为碱基对，下方的数字显示为该电泳条带的bp值。 具体实施例方式 一、试剂盒包含的试剂及说明 本专利技术包括以下试剂共11种，分别为TRIZOL、氯仿、异丙醇、乙醇、Oligo(dT)15、试剂I、试剂II、试剂III-a、试剂III-b、试剂III-c和试剂III-d。其中，TRIZOL、氯仿、异丙醇、乙醇为组织总RNA提取试剂，Oligo(dT)15和试剂I为mRNA反转录为cDNA试剂，试剂II为TaKaRa公司PCR操作试剂，试剂III-a为基因GDF-15的PCR引物，试剂III-b为基因BCL-2的PCR引物，试剂III-c为基因CTNNB-1的PCR引物，试剂III-d为基因β-actin的PCR引物。 具体如表1′所示，其中试剂I、试剂III和试剂IV的具体组份见表2′～表4′。表1′本专利技术试剂盒所包含的试剂 注本表所列试剂的量为10个样本反应 表2′试剂I的组份 表3′试剂II的组份 表4′试剂III的组份 注GDF-15，英文全称是Growth differentiation factor 15，在Genebank中的基因编号是NM_004864；BCL-2，英文全称是B-cell CLL/lymphoma 2，在Genebank中的基因编号是NM_000633；CTNNB-1，英文说明是Cadherin-associated protein beta 1，在Genebank中的基因编号是NM_001904；β-actin，英文全称是Homosapiens actin beta(ACTB)，在Genebank中的基因编号是NM_001101.2。 上述各基因引物可以通过本领域技术人员通过现有基因合成仪合成，其基本信息表述如下 (1)一般信息 (ii)专利技术名称 (iii)序列数目8 (2)SEQ ID NO1的信息 (i)序列特征 (A)长度22bp (B)类型核酸 (C)链性单链 (D)拓扑结构线性 (ii)分子类型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO1 CGCTCCAGACCTATGATGACTT 22 (3)SEQ ID NO2的信息 (i)序列特征 (A)长度18bp (B)类型核酸 (C)链性单链 (D)拓扑结构线性 (ii)分子类型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO2 CCTTGAGCCCATTCCACA 18 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒，其特征在于由以下试剂组成： ＴＲＩＺＯＬ、氯仿、异丙醇、乙醇、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）↓［１５］、试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ－ａ、试剂Ⅲ－ｂ、试剂Ⅲ－ｃ和试剂Ⅲ－ｄ， 其中，试剂Ⅰ由ＭｇＣｌ↓［２］、Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ＋ＫＣＬ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ↓［２］Ｏ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、ＲＮａｓｅ Ｉｈｉｂｉｔｏｒ、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ组成； 试剂Ⅱ由Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ＋ＫＣＬ、灭菌蒸馏水、ＴａＫａＲａ ＥＸＴａｑ ＨＳ组成； 试剂Ⅲ－ａ为基因ＧＤＦ－１５的ＰＣＲ引物，试剂Ⅲ－ｂ为基因ＢＣＬ－２的ＰＣＲ引物，试剂Ⅲ－ｃ为基因ＣＴＮＮＢ－１的ＰＣＲ引物，试剂Ⅲ－ｄ为基因β－ａｃｔｉｎ的ＰＣＲ引物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭剑津，张天光，史培荣，陈显久，刘玮玮，李冰，解军，牛勃，程牛亮，赵荣瑞，郭巍伟，
申请(专利权)人：陈显久，
类型：发明
国别省市：14[中国|山西]
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