通过PCR检测反刍动物DNA制造技术

本发明专利技术提供扩增、测量和／或检测样品中反刍动物ＤＮＡ的方法、组合物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过PGR检测反刍动物DNA相关申请的交叉引用 本申请要求享有2004年1月30日提交的美国临时专利申请No.60/540，757的优先权，其全部公开内容经引用并入本文。联邦赞助研究和开发下所作专利技术权利的声明不适用。
技术介绍
牛海绵样脑病(BSE)或"疯牛"病首先于1986年在大不列颠发现，并传播到欧 洲大陆的国家(例如见Anderson W <//.， Atotwe 382:779-88 (1996))。随后的流行病学 研究已经鉴定到牛饲料中的来自感染瘙痒症的绵羊的提取材料是BSE的最可能的最 初原因。BSE的致病因子即朊病毒从提供的动物内脏传播给牛。通过包括提取的牛 肉和骨粉(BMBM)作为动物饲料的成分使BSE进一步传播(例如见Wilesmith W及ec. 123:112-3 (1988))。 BSE现已在英国、欧洲、日本和北美包括加拿大和美国 发现(例如见Normile， Sc/e"ce， 303:156-157 (2004))。1997年，作为对BSE传播的流行病学证据的反应，美国食品药品管理局(FDA) 禁止在反刍动物饲料中掺入某些哺乳动物组织(如来源于CNS的组织和肠组织)(例 如见62(108) Federal Register 30935-78 (June 5， 1997))。被认为具有最小风险的产品， 包括提供给人消费的血、血制品、明胶、乳和乳制品、仅来源于猪或马的蛋白质和检 验的肉制品被初步排除在禁令之外。2004年l月，USDA禁止向任何人食品包括可 能进入人食品供应的任何食品中掺入"指定的危险材料"，即30个月和更老牛的颅骨、 脑、三叉神经节、眼、脊柱、脊髓和背根神经节，以及任何年龄牛的扁桃体和小肠的 回肠末端。同月，FDA将禁令扩展到哺乳动物血和血制品、餐馆的来自反刍动物食 物的未吃的肉和其它剩饭。此外，FDA还建议来自出生或居住于已经出现BSE国家的动物的牛源材料不应 该用于制造FDA管理的将用于人的产品(包括，例如，疫苗)。FDA还推荐在化妆 品制造中应该避免使用高风险牛源蛋白质。目前，对遵守的估计基于伴随签字和FDA现场访问的信誉制度，其中检查制造 方案和记录保持。目前可用于确定动物饲料中是否存在反刍动物来源蛋白质的验证性 测试是耗时的显微检査方法(Tartaglia efflUFoorfiVW. 61(5):513-518 (1998)),该 方法具有大于5%词料重量的较低检测限，或据报道具有1重量％-5重量％检测限的 免疫学测试("Reveal " Neogen Corp., Lansing MI)。自从实行初步禁令，开发提取和鉴定样品(如反刍动物词料、宠物食品、化妆品、 人食品和营养保健品(mitmceuticals))中禁止添加剂的方法已经受到研究人员的很 多关注。例如，Tartaglia " a/" F卯rf/V" 5:513-518 (1998); Wang " /.，細.CV// /Vo6m 1:1-5 (2000);禾Q Kremar and Rencova, /. 1:117-119 (2001)描述了提取和鉴定牛线粒体DNA的方法。Myers Wfl/.， /. F卯rf/VW. 4:564-566 (2001)比较了核 酸提取方法。然而，这些方法都没有解决饲料中存在干扰DNA检测的抑制剂的问题， 因此引起假阴性结果的高发生率。解决存在PCR抑制剂的商品试剂盒可以获得 (Qiagen Stool Kit, Qiagen Inc， Valencia CA， 91355),但正如以下实施例中所讨论的， 使用这种试剂盒不能消除动物饲料中存在的所有PCR抑制剂。基于酶标记免疫测试 系统(ELISA)的商品筛选试剂盒鉴定牛饲料中的反刍动物污染物(Neogen AgriScreen, Lansing MI, 48912),但该试剂盒依赖于牛词料中反刍动物蛋白质的存 在，并且不解决饲料中可能存在微量反刍动物蛋白质的问题。线粒体DNA (mtDNA)的聚合酶链式反应(PCR)的应用已经被研究用于检测 反刍动物饲料中牛污染物的存在(Tartaglia e"/.， 61(5):513-518 (1998))。然而，该方法不能检测低于0.125重量％的污染物水平，并需要过夜培养步骤。研究 人员还建议使用限制性内切酶分析扩增产物以确保扩增产物特异性的附加步骤。不能检测到动物食品供应、人食品供应、疫苗、营养保健品或化妆品中存在禁止 的反刍动物蛋白质的假阴性结果，能直接或间接导致这些物质被禁止的反刍动物蛋白 质污染。由于增加BSE的风险，这种污染物能对公众健康有显著的不利影响。此外，由于剧烈增加与监测产品反刍动物材料相关的成本，较高的污染风险对食品、化妆品 和疫苗工业具有潜在破坏性影响。在进入食品、疫苗或化妆品之前检测任何食品、疫 苗或化妆品中的反刍动物材料的更灵敏测试将既增加检测由反刍动物材料引起的食 品、疫苗或化妆品污染的效率，还大大降低了BSE对公众的危险。因此，本领域需要检测反刍动物DNA的另外的方法和组合物。尤其是，需要更 灵敏和准确地检测反刍动物DNA的方法，减少和/或消除假阴性。本专利技术致力于这些 和其它需要。
技术实现思路
本专利技术提供扩增、测量和/或检测样品中反刍动物DNA的方法和试剂盒。 本专利技术的一个实施方案提供扩增样品(例如动物饲料、动物词料成分、化妆品、 营养保健品、疫苗、胶体灌输液或其组合)中反刍动物DNA的方法，包括使来自样 品的核酸与RNA酶(如RNA酶A、 RNA酶B、 RNA酶D、 RNA酶E、 RNA酶H、 RNA酶I、 RNA酶P、 RNA酶S、 RNA酶T、 RNA酶V及其组合)接触从而产生 RNA酶处理的核酸；用第一反刍动物特异性引物和第二反刍动物特异性引物扩增 RNA酶处理的核酸以扩增样品中存在的反刍动物DNA，从而产生第一种扩增反刍动 物DNA。在一些实施方案中，所述方法还包括检测扩增的反刍动物DNA。在一些实施方案中，所述方法还包括用第三反刍动物特异性引物和第四反刍动物特异性引物扩 增第一种扩增的反刍动物DNA。在一些实施方案中，在使所述核酸与RNA酶接触之 前从样品中分离核酸。在一些实施方案中，待检测的反刍动物DNA来自牛、绵羊、 山羊、麋鹿、鹿及其组合。在一些实施方案中，RNA酶处理的核酸通过将所述分离 的核酸与所述RNA酶在约30'C-约40'C接触约15分钟-约120分钟而制备。在另一 些实施方案中，RNA酶处理的核酸通过将所述分离的核酸与所述RNA酶在约37°C 接触约60分钟而制备。在一些实施方案中，反刍动物DNA包含线粒体DNA序列(如 细胞色素c、细胞色素b、 12S RNA、 ATP酶亚基8、 ATP酶亚基6、 ATP合成酶、 亚基8，及其亚序列)。在一些实施方案中，反刍动物特异性引物对是SEQIDNO:l 和2; SEQIDNO:3和4;或SEQ ID NO:ll和12。在一些实施方案中，样品是动物词料(如牛油、乳或其组分)。在一些实施方案中，动物饲料是牛饲料(如包含约0.5 %-约30%、约0.75%-约20%、或约1%牛油)。在一些实施方案中，所述方法还包 括检测扩增产物(如通过检测与扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
扩增样品中反刍动物ＤＮＡ的方法，所述方法包括：　使来自所述样品的核酸与ＲＮＡ酶接触，从而生成ＲＮＡ酶处理的核酸；和　用第一反刍动物特异性引物和第二反刍动物特异性引物扩增所述ＲＮＡ酶处理的核酸，从而扩增所述样品中存在的反刍动物ＤＮＡ并生成扩增的反刍动物ＤＮＡ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯卡勒，韦恩史密斯，加布里埃尔伦森，玛丽索耶，本涅奥斯本，爱丽丝翁，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：US[美国]