一种深海适冷微生物胞外多糖的制备方法技术

一种新的深海适冷微生物胞外多糖的制备方法，属于海洋生物技术领域。本发明专利技术提供以胞外多糖产率高的深海适冷菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｓｐ．ＳＭ９９１３为菌株通过液体深层发酵制备胞外多糖的工艺，得到分离纯化的胞外多糖，解析其结构，乙酰基的引入使分子的伸展变化，导致多糖羟基基团的暴露，增加其在水中的溶解性，从而提高其生物活性。本发明专利技术的所制备的多糖纯品可广泛用于药物、生物技术领域、食品、环保、化妆品等领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的深海适冷微生物胞外多糖的制备方法，属于海洋生物

技术介绍
60％的海洋是深度超过2000米的深海，深海是一个特殊的生态环境，这里永久低温(深海热液口是高温环境)、高压、黑暗、高盐、寡营养。深海中生活着多种极端微生物，比如嗜(耐)热菌、嗜(适)冷菌、嗜(耐)压菌、嗜(耐)盐菌等。深海热液口区域的微生物是目前研究的热点领域。过去十年，科学家对深海热液口微生物分泌的胞外多糖(Exopolysaccharides EPSs)的结构与功能进行了大量的研究，主要是热液口附近的中温菌分泌的多糖交替单胞菌属、假交替单胞菌属和弧菌属。热液口微生物分泌的胞外多糖与其他生态环境中微生物分泌的胞外多糖的结构不同，表现在糖醛酸含量高(高达10～40％)和高度乙酰化上，使得这些多糖粘度较高，对金属离子、微生物菌体自身以及蛋白颗粒具有较强的结合能力。深海热液口的微生物资源被认为是能够分泌新型特殊功能多糖的重要资源。因为，一方面，深海热液口微生物分泌的胞外多糖的特殊结构，预示其具有新的潜在的生物学功能，在生物
中将有新的用途；另一方面，深海极端环境下胞外多糖可以作为研究极端环境下生物大分子稳定性保护的模式材料。因此，深海微生物多糖的研究日益引起了各国科学家的重视，已经成为微生物学领域研究的热点，同时，也成为各国竞争的焦点。我国应该加强深海微生物多糖的研究，从而能在这一海洋生物高
占有一席之地。微生物多糖是重要的生物技术产品，在药物、生物
、食品、环保、化妆品等领域具有广泛的应用。微生物多糖的种类很多，多糖的结构决定其功能。深海区域由于其高压、高盐、低温等独特的极端生态特性，因此，深海微生物分泌的胞外多糖应该具有新的结构特性。过去关注更多的是深海热液口微生物分泌的胞外多糖的结构及其在微生物适应热液口极端环境中的作用。但是，深海热液口在整个深海海底中所占的面积很少，而且，在该区域生长的微生物大多都是嗜(耐)热菌或中温菌。而深海海底绝大部分区域是一个高压、低温、弱光、寡营养的海水流动的环境，这些区域生长着大量的嗜(适)冷微生物。2001年，陈秀兰等人首次报道了深海适冷菌Pseudomonas sp.SM9913的菌株筛选及特征与鉴定，参见陈秀兰等，“深海适冷菌SM9913产生的低温蛋白酶”，《海洋科学》2001年，第5卷，第1期，第4-8页。中国专利01127405.0公开了利用该菌株生产适冷风味蛋白酶的方法。但到目前为止，对深海适冷微生物胞外多糖的结构与功能的研究，尚未见报道，而对该问题的研究，对于深海微生物利用而言具有更普遍的意义，值得深入探讨。本专利技术提供。本专利技术首先提供以胞外多糖产率高的深海适冷菌Pseudomonas sp.SM9913为菌株，通过液体深层发酵制备胞外多糖的工艺，得到分离纯化的胞外多糖，解析其结构，为其在生物
的应用奠定基础。本专利技术的技术方案如下，包括如下步骤(1)种子制备培养基豆饼粉2～3份、玉米2～3份、麸皮1～1.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份和水100份，均为重量份，培养基100-120℃灭菌30-50分钟，冷却后，以深海适冷菌Pseudomonas sp.SM9913为菌株(参见陈秀兰等，“深海适冷菌SM9913产生的低温蛋白酶”，《海洋科学》2001年1月19日，菌株持有人山东大学)，接茄子瓶菌种的菌悬液，接种量5-7％质量百分比。通风，搅拌，培养。得种子液，待用。优选的，上述培养基中加豆油300～350毫升作消泡剂。优选的，上述种子制备是在150升发酵罐中装样量70升，于10～12℃下，通风1∶0.5～0.6，搅拌320～330转/分，培养36～48小时。胞外多糖产量约5克/升。(2)液体深层发酵制备胞外多糖发酵液培养基，豆饼粉3～3.5份、玉米粉2.5～3份、山芋粉2.5～3份、麸皮2.0～2.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份和水100份，均为重量份。1000升发酵罐，装450升培养基，灭菌后pH6.2～6.3，接种步骤(1)制备的种子5～7％，搅拌200～220转/分，控制通风量0-12小时1∶0.5～0.6，12-20小时1∶0.6～0.7，20-28小时1∶0.8～0.9，控制培养温度10～12℃，发酵48～72小时。每升产多糖量可达5克。优选的，上述培养基中加豆油1～1.2公斤作消泡剂。(3)胞外多糖发酵液的后处理上述胞外多糖发酵液经10000rpm离心，然后离心上清液用无水乙醇沉淀，上清液体积与无水乙醇体积比例为1∶3，除蛋白、脱色后，离心干燥得到多糖粗制品。多糖粗品在60～70℃热水中重溶，浓缩至原体积的20～30％，再经过凝胶过滤层析和离子交换层析技术分离，真空冷冻干燥，得到多糖的纯品。最后，经质检、分装成胞外多糖产品。上述步骤(1)中所述的茄子瓶斜面菌种的制作可按已有技术。本专利技术提供如下具体操作步骤以0.2～0.4份牛肉膏、0.8～1.2份蛋白胨、1.5～2份琼脂、0.4～0.6份NaCl为培养基，水95～100份，pH为7.0～7.2，灭菌，在试管斜面上，划线接深海适冷菌Pseudomonassp.SM9913菌种，12～15℃培养24～26小时，贮藏于4℃。将上述菌种移入茄子瓶斜面(培养基与保藏斜面相同)，12～15℃培养24～26小时，作菌悬液用。上述步骤(3)凝胶过滤层析和离子交换层析中优选凝胶过滤层析柱100cm×1.2cm，凝胶类型Sephadex G-100。离子交换层析柱25cm×1.6cm，凝胶类型DEAE-Sepharose Fast Flow。下面结合胞外多糖的结构解析，对本专利技术做进一步说明。本专利技术方法所制备的多糖纯品经过1D、2D-NMR、MS、甲基化分析得到此多糖的主要结构组成重复单元为{→6)--α-D-Glcp-(1→6)--α-D-Glcp-(1→6)--α-D-Glcp-(1→6)--α-D-Glcp-(1→}n其中糖单元∶乙酰基∶乙醇基＝4∶5∶1，高度乙酰化的α-(1→6)构成多糖主链的核心结构(61.8％)，多糖链的末端还存在少量的Ara(11.0％)、Xyl(3.9％)、Gal(3.1％)、(1→4)Glc(5％)和(3→6)Glc(4％)。从此胞外多糖结构中，可以看出高度乙酰化能够改变多糖分子的定向性和横向次序，从而改变多糖的物理性质，乙酰基的引入使分子的伸展变化，最终导致多糖羟基基团的暴露，增加其在水中的溶解性，从而达到提高其生物活性的效果。本专利技术的所制备的多糖纯品为生物技术产品，在药物、生物
、食品、环保、化妆品等领域具有广泛的应用。本专利技术的技术特点在于1、海洋作为一个特殊的极端环境，海洋微生物分泌的EPS应该具有特殊的结构与功能，已经日益引起各国科学家的关注。近年来，已经对深海热液口的中温及耐热微生物和极地适冷微生物分泌的EPS的结构与功能进行了许多研究，发现了多种新的结构和功能的EPS。但关于深海适冷微生物分泌的EPS的结构与功能的研究，至今未见报道。因为，世界上60％以上的环境都是深度超过2000米的深海，其中绝大部分都是低温环境。2、首次以深海适冷菌Pseudomonas 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种深海适冷微生物胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：（１）种子制备培养基：豆饼粉２～３份、玉米２～３份、麸皮１～１．５份、Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］０．４～０．５份、ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］０．０３～０．０４份和水１００份，均为重量份，培养基１００－１２０℃灭菌３０－５０分钟，冷却后，以深海适冷菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＳＭ９９１３为菌株，接茄子瓶菌种的菌悬液，接种量５－７％质量百分比；通风，搅拌，培养；得种子液，待用；（２）液体深层发酵制备胞外多糖发酵液培养基：豆饼粉３～３．５份、玉米粉２．５～３份、山芋粉２．５～３份、麸皮２．０～２．５份、Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］０．４～０．５份、ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］０．０３～０．０４份和水１００份，均为重量份；１０００升发酵罐，装４５０升培养基，灭菌后ｐＨ６．２～６．３，接种步骤（１）制备的种子５～７％，搅拌２００～２２０转／分，控制通风量０－１２小时１：０．５～０．６，１２－２０小时１：０．６～０．７，２０－２８小时１：０．８～０．９，控制培养温度１０～１２℃，发酵４８～７２小时；（３）胞外多糖发酵液的后处理上述胞外多糖发酵液经１００００ｒｐｍ离心，然后离心上清液用无水乙醇沉淀，上清液体积与无水乙醇体积比例为１∶３，除蛋白、脱色后，离心干燥得到多糖粗制品。多糖粗品在６０～７０℃热水中重溶，浓缩至原体积的２０～３０％，再经过凝胶过滤层析和离子交换层析技术分离，真空冷冻干燥，得到多糖的纯品。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉忠，秦国奎，陈秀兰，周维芝，何海伦，石梅，张熙颖，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]