本发明专利技术涉及一种抗膀胱癌靶向超抗原，包含靶向部分和超抗原部分，靶向部分为可与膀胱癌细胞特异性结合的抗膀胱癌单克隆抗体ＢＤＩ－１片段，超抗原部分为金黄色葡萄球菌的肠毒素Ａ（ＳＥＡ），二者以化学连接剂３－（２－吡啶二巯基）丙酸Ｎ－羟基琥珀酰亚胺酯连接而成如下通式：（ＢＤＩ－１Ｆａｂ－ＮＨＯＣＣＨ↓［２］ＣＨ↓［２］ＳＳＣＨ↓［２］ＣＨ↓［２］ＣＯＮＨ）↓［ｎ］－ＳＥＡ，ｎ≤７。本靶向超抗原既保留了ＢＤＩ－１Ｆａｂ对膀胱肿瘤细胞的靶向性，又保持了ＳＥＡ强大的活化Ｔ淋巴细胞杀伤膀胱肿瘤细胞作用，将其应用于膀胱灌注治疗，疗效显著，且低毒、安全。本发明专利技术采用化学偶联法制备Ｆａｂ－ＳＥＡ，简化了制备工艺，便于产业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种应用于膀胱灌注的。
技术介绍
膀胱癌发病率位居我国泌尿生殖系恶性肿瘤第一位，且呈逐年上升趋势。膀胧癌中 超过卯。/。是移行细胞癌(transitional cell carcinoma,TCC)，而其中约75 85%为局限在粘 膜层和固有层的浅表性膀胱癌(superficial bladder cancer,SBC)。对SBC患者可采用经 TURBT和膀胧部分切除术；但术后10%-67%的患者在12个月内，24%-84%的患者在5 年内复发甚至进展。因此术后膀胱灌注化疗或免疫治疗是SBC的标准治疗方案。然而膀胱灌注化疗不同于系统化疗，药物的疗效不是与药物剂量而是与局部药物的 浓度成正比，同时还依赖于药物与膀胱壁的接触时间、灌注药物的最佳pH值等因素。由 于大部分化疗药物可溶性差，易在灌注后第一次排尿时排出；同时不少药物刺激性较大， 膀胱灌注可引起局部粘膜糜烂、尿道损伤引发尿道狭窄等，因而目前应用的药物不是疗 效较差,就是副作用太大,使得标准方案并不能按标准进行。BCG (减毒牛型结核分支杆菌疫苗)膀胱灌注免疫治疗是另一标准方案,作为一种 外源性的免疫刺激剂，通过诱导极强的非特异性免疫反应来发挥机体本身的抗肿瘤效 应。但BCG既然是活疫苗,就仍有一定致病力，在术后膀胱黏膜未痊愈时更是如此，可 出现包括各器官、系统分支杆菌感染以及多种变应性疾病在内的多种严重并发症。改良 使用减毒株或其胞壁成分虽可减少但并不能从根本上改变BCG的毒副作用。超抗原(Superantigen，下称SAg)是一类由细菌外毒素和逆转录病毒蛋白构成的抗原 性物质，它不需要抗原提呈细胞加工处理,以完整的蛋白质分子形式直接与胞膜MHCII类 分子抗原结合槽外侧结合，导致带有特异性V卩节段T细胞大量活化增殖，并使之释放多 种细胞因子，通过以下两种途径对肿瘤产生强大的杀伤作用①SAg依赖的细胞介导的细胞毒作用(superantigen dependent cell mediated cyto-toxicity ，下称SDCC): SAg激活CD8+杀伤力很强的抑制T细胞或细胞毒性T细胞 (cytotoxic or suppressor T lymphocytes ，CTL)和CD4+辅助性(helper)T细胞，直接或间接地杀伤表达MHCn类分子的肿瘤细胞。②细胞因子参与的抑瘤作用被激活的T细胞所释放多种细胞因子非特异地直接 或间接杀伤肿瘤细胞，这些细胞因子主要包括肿瘤坏死因子-a (TNF- a )、白细胞介素 -2(IL-2)、干扰素-Y(IFN-Y)等。与BCG相比较，其抗瘤作用类似，但激活的T细胞范 围更广，释放的细胞因子更多，因而抗瘤作用更为强大，在抗膀胱癌的体内外研究中效果 显著。然而，单纯使用SAg灌注治疗膀胱癌虽然避免了全身应用SAg可能导致的免疫紊 乱等毒副作用，但仍存在着抗瘤谱窄(MHCir肿瘤细胞的低杀伤性等)和靶向性差(同 时杀伤MHCn+的正常细胞等)的缺陷。
技术实现思路
本专利技术针对当前膀胱癌灌注治疗效果差、毒副作用大或抗瘤普窄、特异性弱等缺点， 提供一种简单、高效的应用于膀胱灌注的抗膀胱癌耙向超抗原及其制备方法。本专利技术抗膀胱癌靶向超抗原包含由耙向部分和超抗原部分，二者之间以化学连接剂 连接，所说的靶向部分为可与膀胱癌细胞特异性结合的抗膀胱癌单克隆抗体BDI-1片 段，所说的超抗原部分为金黄色葡萄球菌的肠毒素A,所说的连接剂为3-(2-吡啶二巯基) 丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(下称SPDP)，其结构通式如下(BDI-lFab-NHOCCH2 CH2 SSCH2 CH2 CONH)n-SEA，其中n《7的整数，优选为4或5。本专利技术抗膀胱癌靶向超抗原包含了单克隆抗体(McAb)耙向的SAg, McAb不仅 能有效地将T细胞及其分泌的细胞因子靶向肿瘤细胞，从而大大降低了对MHCn阳性 正常细胞的杀伤，同时还起到了类似于MHCn的抗原递呈作用，SDCC对表达McAb 靶向相关抗原的MHCn'肿瘤细胞也有杀伤作用。而由重链VH、 CHl及完整轻链构成 的McAbFab段既保持了 McAb的靶向性，又避免McAbFc段与非癌组织的非特异性结 合，同时穿透性更好，与SAg联合可更好的发挥靶向抗肿瘤效应。本专利技术提供该抗膀胱癌靶向超抗原制备方法，包括以下步骤(1) 抗膀胱癌单克隆抗体BDI-lFab段的制备及纯化BDI-1加木瓜蛋白酶和(3-巯基乙醇，反应得Fab,用磷酸缓冲液(Phosphate Buffered Saline,下称PBS)透析后上蛋白G柱纯化，收集流出峰，超滤离心浓縮，加 双蒸水和1M Bacine， PH为9.0,得PH8.5含BDI-lFab的Bacine混合体系备用；(2) 用化学连接剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP )制备BDI-lFab-SEA抗膀胱癌靶向超抗原将肠毒素A (SEA)和步骤(1)所得Bacine混合液分别以6、 IO倍过量的摩尔比 加入连接剂SPDP，反应得SEA-PDP和Fab-PDP，分别离心取上清，加醋酸钠缓冲液超 滤浓縮3次；SEA-PDP中加入1M的二硫代苏糖醇(DTT)反应得SEA-SH,离心，上 清加醋酸钠缓冲液，超滤浓縮3次后，加入5倍摩尔过量的Fab-PDP，混合，4'C摇床 偶联过夜，得含有BDI-lFab-SEA的混合物；(3)抗膀胱癌靶向超抗原的纯化步骤(2)所得偶联混合物，离心，取上清，过suiperdex-200柱，以蛋白质液相层 析系统(High performance Liquid Chromatography,下称HPLC)纯化并收集产物。综上所述，本专利技术将靶向超抗原抗肿瘤模式引入到膀胱癌的治疗领域，抗膀胱癌靶 向超抗原既保留了 BDI-lFab对膀胱肿瘤细胞的靶向性，又保持了 SEA强大的活化T淋 巴细胞杀伤膀胱肿瘤细胞作用，克服了单纯SAg治疗膀胱癌抗瘤普窄、特异性差的缺点； 沿用我们以往的局部运用SAg抗肿瘤战略，将抗膀胱癌靶向超抗原应用于膀胱灌注治 疗，避免全身应用可能引起机体免疫调节功能紊乱及毒素中毒综合征等毒副作用，具有 低毒、安全性；与全身应用耙向超抗原抗肿瘤战略不同，本膀胱灌注的抗膀胱癌靶向超 抗原可直接使用鼠源单克隆抗体而不必用基因工程技术将其人源化。本专利技术采用化学偶 联法制备Fab-SEA，简化了制备工艺，便于产业化生产，有望发展成为简单、高效、安 全的抗膀胱癌免疫灌注治疗的靶向药物。附图说明图1是抗膀胱癌靶向超抗原的制备与纯化色谱图，其中A为BDI-1酶切所得Fab 纯化色谱图，B为SEA洗脱色谱图C为制备的抗膀胱癌靶向的超抗原纯化色谱图。图2为抗膀胱癌靶向超抗原SDS-PAGE分析图谱，其中A为纯化前样品电泳图；B 为抗膀胱癌靶向超抗原纯化后的第一峰样品电泳图。图3为免疫组化法鉴定抗膀胱癌靶向超抗原的抗膀胱癌抗体靶向活性，其中A为以 膀胱癌细胞为抗原片、抗膀胱癌靶向超抗原为一抗实验组阳性结果；其中，B、 C为以 SEA、 PBS代替抗膀胱癌靶向超抗原为一抗的对照组阴性结果；D为以结肠癌细胞代 替膀胱癌细胞为抗原片的对照组阴性结果。图4为抗膀胱癌靶向超抗原促T淋巴细胞增殖活性的鉴本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗膀胱癌靶向超抗原，其特征是包含由靶向部分和超抗原部分，二者之间以化学连接剂连接，所说的靶向部分为可与膀胱癌细胞特异性结合的抗膀胱癌单克隆抗体ＢＤＩ－１片段，所说的超抗原部分为金黄色葡萄球菌的肠毒素Ａ，所说的连接剂为３－（２－吡啶二巯基）丙酸Ｎ－羟基琥珀酰亚胺酯ＳＰＤＰ，其结构通式如下： （ＢＤＩ－１Ｆａｂ－ＮＨＯＣＣＨ↓［２］ＣＨ↓［２］ＳＳＣＨ↓［２］ＣＨ↓［２］ＣＯＮＨ）↓［ｎ］－ＳＥＡ， 其中ｎ≤７的整数。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩从辉，贡震，郝林，
申请(专利权)人：徐州市中心医院，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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