本发明专利技术涉及由调节磷酸酶产生的ｐＨ０８１基团启动子活性的ＤＮＡ，这种ＤＮＡ是从啤酒酵母得到的．应用从真核微生物酵母得到的上述新的和有效的启动子，可以有效地生产药理学上重要的蛋白质类物质．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
这项专利技术涉及含有从酵母菌得到的启动子的新的DNA及其在遗传工程中的应用。随着DNA重组技术的广泛应用，利用无核或真核生物生产有用的多肽现已成为可能。迄今为止，大肠杆菌被用于大规模生产多肽，然而，希望应用真核生物来生产药理学上特别重要的多肽。酵母菌是一类真核微生物，与哺乳动物细胞有许多相似之处，因此用于哺乳动物蛋白质编码基因的表达是有利的。而且酵母菌在它们细胞中确不含内毒素，易于培养。酵母菌的培养过去一直在大的工业规模上进行，它的安全性是肯定无疑的。此外，已经进行了许多研究，去阐明它们遗传的生物学机制。围绕酵母菌的上述情况，都已导致它们作为宿主生物用于遗传工程中。目前已知有几种酵母菌基因克隆体。然而，对能有效地表达外源基因的酵母菌启动子还了解甚少。已知在一株啤酒酵母的裂解物中，存在有两种酸性磷酸酶和两种碱性磷酸酶。发现酸性磷酸酶在细胞的表面。其中一种酸性磷酸酶的产生受无机磷酸盐的抑制，而另一种酸性磷酸酶是通过结构改变产生的。一种碱性磷酸酶是一种阻遏酶，无机磷酸盐能抑制它的产生，而且有广泛的底物特异性。另一种碱性磷酸酶是一种特殊的对硝基苯磷酸酶，它的底物仅是对硝基苯磷酸盐，而且这个酶的产生是通过结构改变的。分离到了缺乏可阻抑的酸性磷酸酶活性的突变体Pho5、Pho4、Pho2和Pho81。PHO5基因是可阻抑的酸性磷酸酶的一种结构基因，而PHO4、PHO2和PHO81基因是产生蛋白质的基因，这种蛋白质能调节可阻抑的酸性磷酸酶结构基因PHO5的表达。进而PHO4和PHO81基因用来调节类似于PHO5可阻抑的碱性磷酸酶结构基因的表达。已经知道了酵母菌进行基因克隆的各种载体，现在都已可以应用。为了有效地表达天然或内源的基因，以及外来的或外源的基因，必须选择一种适合于所用宿主菌的有效的酵母菌启动子。图1是含有PHO81基因的DNA片段插入质粒PAC4的限制性内切酶图谱;图2是DNA片段及其根据本专利技术克隆的PHO81基因和PHO81启动子衍生物的限制性内切酶图谱及PHO81突变的互補能力的图示说明;图3是PHO81转录产物鉴定的说明;图4说明含有PHO81的克隆的DNA片段进行碱基序列分析的策略;图5表示PHO81基因启动子区域的核苷酸序列;图6是构建PAC430质粒的图解;图7是为了adr型肝炎B病毒表面抗原基因表达，构建重组DNA的图解;图8是构建lacz表达质粒的图解;图9表明含有PHO81基因的DNA序列。本专利技术注意到了PHO81基因的启动子(下文中称为PHO81启动子)，PHO81基因是表达酵母菌可阻抑的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶结构基因表达的一种调节基因。本专利技术者已经克隆了PHO81基因，测定了克隆DNA的限制性内切酶酶切图谱，并测定了它的启动子区域的核苷酸顺序。结果，发现该启动子是一种新的DNA，并适于有效地表达外源的和天然的基因。在以前研究的基础上作出了本专利技术。本专利技术提供了一种能调节磷酸酶产生的PHO81基因的启动子活性，并能从啤酒酵母得到的一种DNA;上述类型的一种重组合DNA;一种在PHO81启动子下游位置上带有编码产生可阻抑的磷酸酶的正调节因子结构基因或其它结构基因的DNA;含有调节磷酸酶产生的PHO81基因启动子活性的DNA，并能从啤酒酵母得到的一种转化子;含有上述PHO81启动子和PHO81启动子下游的结构基因DNA的转化子;基因产物生产的过程，包括在培养基中培养含有调节磷酸酶产生的PHO81基因启动子活性的DNA的转化子步骤，这一DNA可从啤酒酵母得到，并且带有位于该PHO81启动子下游的结构基因，因而，转化子生长伴随有基因产物的积累而从培养液中可以回收基因产物。具有PHO81基因启动子活性的上述DNA，最好是用磷酸来调节它的转录。有PHO81基因启动子活性的上述DNA最好是具有图9中位置Ⅰ和限制性内切酶SmaⅠ( )酶切位点之间的碱基顺序的DNA。依据本专利技术，含有PHO81启动子以及编码产生可阻抑的磷酸酶的正调节因子结构基因(PHO81结构基因)的DNA，可以从酵母菌细胞中分离并收集到。任何菌株的啤酒酵母可以用于这一目的。尤为适用的菌株是一株属于酵母属的菌株，如啤酒酵母。商业上可以得到的面包酵母菌和啤酒酵母菌是适用酵母特有的实例。根据Methods in Cell Biology，12，13-14(1975)所述方法，从酵母菌中可有效地提取DNA。所提取的DNA用适当的限制性内切酶处理得到DNA片段。经如上相同的限制性内切酶处理或用能形成相同粘性末端的限制性内切酶酶切过的质粒或噬菌体，与这种DNA片段相连接，从而得到基因库。这种质粒可以是pBR322或大肠杆菌-酵母菌穿梭载体YEP13〔Gene，8，121，(1979)〕。噬菌体可用Charon噬菌体〔J.Virol，29，555，(1979)〕。如若需要，可用大肠杆菌-酵母菌穿梭载体YEp6进一步产生亚克隆(Gene，8，17，(1979)〕。然后，用带有如此克隆过的DNA的载体去转化宿主菌株。宿主菌最好是酵母菌，特别是酵母属的菌株，最好是啤酒酵母种的菌株，啤酒酵母NA95-4B菌株更好。不过最好还是选择PHO81突变株作为宿主菌。菌株NA95-4B可用常规的杂交方法得到〔Handbook of Genetics，366，Plenum Press，New York(1974)〕。即通过与菌株AL211-12B(MATa，PHO 3-1，PHO8，arg6)〔Mol.Cell.Biol.，2，127(1982)〕，菌株AH22(MATa，leu2，his4，can1)〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，1(1983)〕，菌株D13-1A(MATa，trp1，his3，gal2，Suc2)〔Proc、Natl、Acad.Sci.USA，76，1035(1979)〕，菌株YAT228(MATa，leu2，lys10，Cyh，Kar1-1)〔J.Bact-eriol.，145，1421(1981)〕和菌株W755-1C(MATa，PHO81，leu2，his3，his4)杂交而可以得到菌株NA95-4B。PHO81突变株用上述构建的基因库或亚克隆DNA进行转化，得到一株质粒，这株质粒含有PHO81启动子和编码产生可阻抑的磷酸酶调节因子的开放阅读框架的PHO81结构基因。能以任何已知方法进行这种转化，例如按照在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978);Nature，275，104(1978);Cold Spring Harbor Symp.，Quant.Biol.，43，1305(1979)和Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035(1979)所述方法之一或其它类似方法进行。不管转化子是否含有PHO81启动子和产生可阻抑的磷酸酶调节因子的PHO81基因的密码区，都可用下面的方法测定。转化子培养在Rubin氏改进培养基中(C.M.Rubin，低磷酸的完全培养基)〔Eur.J.Biochem.，41，197(1974)〕形成菌落。然后在培养基上铺上一层含有α-磷酸萘酯和坚牢蓝盐B的琼脂层。如果克隆的D本文档来自技高网...
【技术保护点】
具有调节磷酸酶产生的ＰＨ０８１基因启动子活性的ＤＮＡ，这种ＤＮＡ可从啤酒酵母得到。
【技术特征摘要】
JP 1986-7-3 155041/86;JP 1985-8-20 180984/851.具有调节磷酸酶产生的PH081基因启动子活性的DNA，这种DNA可从啤酒酵母得到。2.按照权利要求1中所述的DNA，其中该PHO81基因的转录受磷酸调节。3.按照权利要求1中所述的DNA和具有图9中位置1和限制性内切酶SmaⅠ酶切位点之间碱基顺序的DNA。4.按照权利要求1、2或3中所述的DNA并是重组的DNA。5.具有PHO81启动子下游结构基因的权利要求1、2、3或4中所述的DNA。6.按照权利要求5中所述的DNA，其中结构基因与产生可阻抑的磷酸酶的正调节因子编码的结构基因不相同。7.按照权利要求6中所述的DNA，其中结构基因是从adw-型肝炎B病毒表面抗原P25基因、adr-型肝炎B病毒表面抗原P31基因和lacZ基因组成的一组基因中选出的。8.含有调节磷酸酶产生的PHO81基因启动子活性的DNA转化子，并能从啤酒酵母得到。9.按照权利要求8中所述的转化子，其中该PHO81基因的转录是受磷酸所调节的。10.按照权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：大秦治，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。