以三甲铵丁烯内酯及/或γ-三甲铵丁内酯为原料,用微生物学方法制造L-肉毒碱.(*该技术在2005年保护过期,可自由使用*)
【技术实现步骤摘要】
人们已知,用r-三甲铵丁内酯(r-Butyrobotaine)作原料可以制造L-肉毒碱(L-Betain)。有一种工艺方法是,在有2-氧代戊二酸钠(Natrium-2-oxoglutarat)、还原剂、铁离子源及作为羟基供给体的空气氧存在下,使r-三甲铵丁内酯与由粗糙链孢霉孢子(Sporen von Neurospora crassa)释放出来的羟化酶相接触(美国书第43 71 618号)。这种工艺方法的缺点是需要很多辅助因素。于是乎在反应中要使化学计算量的2-氧代戊酸盐(2-Oxoglutarat)用氧化法脱去羧基、生成丁二酸盐(Succinat)。作为O2的活化剂,需用Fe2+;为使铁离子保持还原态,需用抗坏血酸;为分解有害的痕迹量H2O2,需用过氧化氢酶(Katalase)。林特施泰特(Lindstedt)等(Biochemistry 6,1262-1270(1967)“The Formation and Degradation of Carnitine in Pseudomonas”)分离出一种以r-三甲铵丁内酯为碳、氮来源而生长成的假单胞菌属微生物。降解过程的第一步反应是将r-三甲铵丁内酯经羟基化反应生成L-肉毒碱,并将中间存在的L-肉毒碱进一步完全分解代谢成CO2、H2O及NH3。即使利用这种由细菌制得的羟化酶(Hydroxylase)来制造L-肉毒碱,也仍存在上述需要辅助因素的缺点(Lindstedt et al,Biochemistry 16,2181-2188(1977)”Purificat-iom and Properties of r-Butyrobetaine Hydrox-ylase from Pseudomonas sp.AK 1”)。本专利技术所赖以为基础的任务是找出一种新的微生物,这种微生物不具有上述已知工艺方法的缺点,并使人们有可能使用简单的方法以三甲铵丁烯内酯(Crotonobetain)、三甲铵丁内酯或其混合物为原料不制造外消旋盐,而制造有拮抗选择性的L-肉毒碱。本专利技术的微生物不同于现有技术中已知系统的是,使用H2O作为羟基供给体,而不使用O2作为羟基供给体。这可以使用H182O及18O2进行仔细的试验来证实。本专利技术所发现的微生物有能力以三甲铵丁烯内酯及/或r-三甲铵丁内酯为原料来生产L-肉毒碱,而且不会将其分解代谢。对取自四大洲的土壤样品进行了对比试验,正如试验结果所表明的那样,到处都存在将三甲铵丁内酯和三甲铵丁烯内酯经由L-肉毒碱进行行分解代谢的微生物。从废水处理设备的加菌淤渣中也可以成功分离出这类微生物。如果将这类微生物按照下面所述的本专利技术原理进行诱变,则有可能将所有这类菌种用来生产L-肉毒碱。这种诱变种可以通过下列选择方法而得到1)将以三甲铵乙内酯(Betain)、r-三甲铵丁内酯、三甲铵丁烯酯及L-肉毒碱为碳、氮来源生长的微生物用常规的方法进行诱变。2)从通过培养得到的已诱变的微生物培养物中选择出那些不分解代谢L-肉毒碱而且不依靠L-肉毒碱、三甲铵丁烯内酯、r-三甲铵丁内酯而仅依靠三甲铵乙内酯生长的稳定微生物。最好在接着的选择步骤2)之后选择出那些分泌L-肉毒碱又不依靠L-肉毒碱、三甲铵丁烯内酯、r-三甲铵丁内酯而仅依靠三甲铵乙内酯生长的微生物。相应地将那些已诱变过的微生物在三甲铵乙内酯培养基中继续培养并在进行选择步骤2)之前,将这些已继续培养过的微生物最好在L-肉毒碱培养基中继续培养。培养以三甲铵乙内酯、r-三甲铵丁内酯、三甲铵丁烯内酯及L-肉毒碱为碳、氮来源生长的菌种相宜地应这样进行,即通过三甲铵丁烯内酯营养液接种使混合培养物由细菌混合物产生出来、然后藉助传统的微生物学技术再用该混合培养物作原料对那些能降解三甲铵丁烯内酯的微生物进行纯培养。这样一种以三甲铵乙内酯、r-三甲铵丁内酯、三甲铵丁烯内酯及L-肉毒碱作为碳、氮来源生长的培养物之诱变,可以按照已知的方法来进行〔J.H.Miller,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,1972〕。制备稳定诱变种的那些合宜方法为移码法、缺失法或者转座子嵌入法。然后,将这些经上述方法诱变过的微生物在三甲铵乙内酯培养基中进一步培养并在转移到L-肉毒碱培养基之后进行选择步骤2),在选择步骤2)中,藉助已知的“反选择剂”〔P.Gerhardtet al(ads.),Manual af Methods for General Bacterio-logy,Am.SOc.for Microbiology,1981〕来选择那些始终不分解代谢L-肉毒碱且不依靠L-肉毒碱、三甲铵丁烯内酯、r-三甲铵丁内酯而依靠三甲铵乙内酯生长的微生物。一种以三甲铵乙内酯、r-三甲铵丁内酯、三甲铵丁烯内酯、L-肉毒碱为碳、氮来源生长的较佳微生物是HK4菌种(DSM Nr.2938)及其后代与诱变种。这种菌种已於1984年3月3日以保藏号Nr.DSM 2938保藏在德意志联邦共和国4300 Goettingen市Griesebach街8号生物技术研究有限公司德意志微生物保藏所。HK4(DSM Nr.2938)菌种的科学描述细胞形态 芽胞杆菌,Z测验多型长度μm 1-2宽度μm 0.5-0.8成活力 +鞭毛 周生革兰氏反应 -子 -聚β-羟基丁酸酯的形成 -氧化酶 +催化酶 +生长厌氧菌 -37℃ +41℃ -PH5.6 -Mac-Conkey氏胆盐琼脂 +SS-琼脂 -Cetrimid氏琼脂 -色素形成作用不扩散 -扩散 -发萤光 -成酸作用(OF测验)由葡萄糖需氧菌 -厌氧菌 -果糖需氧菌 -ASS葡萄糖 +木糖 +海藻糖 +乙醇 -自葡萄糖的成气作用 -ONPG +精氨酸双氢酶 -赖氨酸脱羧酶 -苯基丙氨酸脱氨酶 -鸟氨酸脱羧酶 -H2S -Voges-Proskauer氏反应 -吲哚 -硝酸盐变成亚硝酸盐 +脱氮 +左聚糖的形成 -卵磷酯酶 -脲酶 +降解淀粉 -明胶 -酪蛋白 -酪氨酸 -吐温80 -脱氧核糖核酸(DNA) +七叶 +基质的使用醋酸盐 -柠檬酸盐 -丙酸盐 -甘氨酸 -己氨酸 -木糖 +果糖 +葡萄糖 +以H2自养生物的生长 -3-内缩糖(3-Ketolactose) -生长三甲铵乙内酯 +L-肉毒碱 +r-三甲铵丁内酯 +三甲铵丁烯内酯 +由上述微生物经诱变及选择后得一种较佳的微生物,它具有稳定性,不但不分解代谢L-肉毒碱反应分泌L-肉毒碱,不依靠L-肉毒碱、三甲铵丁烯内酯及r-三甲铵丁内酯而依靠三甲铵本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用诱变后再选择技术制造生产L-肉毒碱的微生物的方法,其特征在于,这种微生物以三甲铵丁烯内酯及/或r-三甲铵丁内酯为原料,而又不分解代谢产物L-肉毒碱。
【技术特征摘要】
1.一种用诱变后再选择技术制造生产L-肉毒碱的微生物的方法,其特征在于,这种微生物以三甲铵丁烯内酯及/或γ-三甲铵丁内酯为原料,而又不分解代谢产物L-肉毒碱。2.根据权利要求1所述方法,其特征在于(1)用以三甲铵乙内酯,r-三甲铵丁内酯、三甲铵丁烯内酯及L-肉毒碱为碳、氮来源生长的微生物做诱变的材料。(2)从经过培养所得到的诱变微生物的培养物中选择那些具有稳定性、不分解代谢L-肉毒碱又不依靠L-肉毒碱、三甲铵丁烯内酯、r-三甲铵丁内酯而依靠三甲铵乙内酯生长的微生物的过程。3.根据权利要求2所述方法,其特征在于,于步骤(2)之后接着选择那些分泌L-肉毒碱又不依靠L-肉毒碱、三甲铵丁烯内酯,r-三甲铵丁内酯而依靠三甲铵乙内酯生长的微生物。4.根据权利要求2或3所述方法,其特征在于将在步骤(2)中诱变了的微生物在三甲铵乙内酯培养基中进一步培养。5.根据权利要求3或4所述方法,其特征在于,将在三甲铵乙内酯中进一步培养过的微生物在L-肉毒碱培养基中进一步...
【专利技术属性】
技术研发人员:汉斯库拉,帕维莱何凯,
申请(专利权)人:隆扎股份公司,
类型:发明
国别省市:CH[瑞士]
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