抗促卵泡激素单克隆抗体及其制备和使用制造技术

本发明专利技术涉及单克隆抗体及其制备方法和使用方法。制备方法包括：提供一种能产生抗ＦＳＨ的Ｂ细胞和一种骨髓瘤细胞，将它们融合并繁殖，产生杂种瘤细胞，采集杂种瘤细胞产生的抗体。使用方法包括：将制备的单克隆抗体用于纯化ＦＳＨ，并将制得的纯ＦＳＨ单独和将其与单克隆抗体合用于哺育动物，以诱发雌性动物动情和（或）增强其生殖能力。Ｃ１２Ｒ１∶０１，１∶１９）（*该技术在2009年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及单克隆抗体及其制备和使用方法。促卵泡激素(FSH或follitropin)是由垂体分泌的一种糖蛋白激素。FSH及其它垂体糖蛋白激素(促黄体激素LH，促甲状腺素TSH)均由α亚基和β亚基构成，这些激素的α亚基是相同的，而β亚基却是不同的，它决定着各激素的特异性。FSH与雄性动物和雌性动物的性功能有关，就雄性动物而言，FSH最重要的作用似乎是与精子成熟和营养有关，而对雌性动物来说，FSH起着促进卵发育和排卵的作用。在胚胎转移过程中，外源性FSH可用于加速排卵，或增加排卵，以得到更高的生殖力。然而，治疗动物的应答变化可能是主要问题，应答变化可能是因为批料变化和在FSH中存在污染物，尤其是有其它垂体糖蛋白激素、LH(促黄体激素)存在之故。现有技术中，提取羊FSH(oFSH)已知的主要方法包括(ⅰ)利用乙醇和酸沉淀，由羔羊垂体腺制备oFSH粗提物(Sherwood，etal(1970)J.BiolChem.2452329-2336)，(ⅱ)硫酸铵沉淀(Reichcrt，L.E.inMethodsinEnzymologyVol.xxxvllFd.O′MalleyB.W.andHardmanJ.G.AcademicPressInc.N.Y.1975)。按照该方法，通过分批加入冷乙醇或硫酸铵，沉淀出不需要的蛋白质。最后一次加入的乙醇或硫酸铵沉淀出活性组分及污染物。这些方法生产出含0.5-1.0iu/mg粗蛋白的FSH粗提物。用垂体粗提物进一步提纯的步骤包括凝胶过滤和离子交换层析(Sherwood，etal，1970，Sairam1979，Grinecti1974)，得到的纯化产品的效能为每mg总蛋白含110至188单位FSH。但是这些方法带来大量花费，浪费时间而且从每个垂体腺中提取的产品量也很少，其结果难以大量满足兽医的使用，尤其是具有稳定效能的FSH。因此，本专利技术的目的是克服或至少是减轻现有技术中诸多难点之一或几个难点。因此，本专利技术首先提供一种抗促卵泡激素(FSH)的单克隆抗体的制备方法，该方法包括提供能产生抗FSH抗体的B细胞和骨髓瘤细胞;使B细胞与骨髓瘤细胞融合;并繁殖生成的杂种瘤细胞。根据本专利技术制备单克隆抗体的方法还包括采集所述杂种瘤细胞产生的抗体。能产生抗FSH抗体的B细胞可选自试验动物的脾细胞和淋巴细胞。该试验动物可以是小鼠、大鼠等。该B细胞可从用FSH免疫的动物或从其致免疫的组织中获得。BALB/C小鼠是最佳免疫动物。一次或多次免疫的动物可用作产生淋巴细胞或脾细胞的抗体源。最佳方法是用多次免疫的鼠的细胞用来制备融合细胞杂种。骨髓瘤细胞可以是任何适宜的类型。现有技术中，众所周知的从淋巴细胞瘤中形成的专门骨髓瘤细胞系，已用于产生杂种瘤的融合过程。有几个骨髓瘤细胞系可用来制备融合的细胞杂种，其中包括P3/x63-Ag8，NS-I型骨髓瘤细胞，例如P3/NSI/1-Ag4-1，Sp2/O-Ag14和S194/5XXO·BU·1。在本专利技术的实例中，NS-I型骨髓瘤细胞(取自BALB/C小鼠)是最佳细胞系。为了产生抗体的脾细胞或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂种细胞，按照本专利技术的融合步骤包括将体细胞与骨髓瘤细胞混合，混合比例大约为20∶1至1∶1，以10∶1为最佳。在能促进细胞膜融合的一种或数种试剂存在下，进行融合。理想的是将同类动物用作融合过程中使用的体细胞和骨髓瘤细胞源。所用的促融合剂可包括仙台(Sendai)病毒或聚乙二醇(PEG)。因为融合方法在很低频率(例如当脾用作体细胞源时，大约每2×105个脾细胞只得到1个杂种)下产生能活的杂种细胞，所以最好有一种能从未融合细胞中尤其是未融合的骨髓瘤细胞中选出融合的细胞杂种的方法。在其它产生融合的细胞杂种中，一种测定所需的能产生抗体的杂种瘤的方法也是必需的。通常挑选融合细胞杂种的方法是在培养基中培育这些细胞，所用培养基只容许杂种瘤细胞生长，而不容许无限分裂下去的骨髓瘤细胞生长。用次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸嘧啶(HAT)培养基来挑选融合细胞杂种，由于脾细胞的HPRT阳性基因型，则融合细胞杂种能在HAT培养基中幸存下来。在容许有遗传能力的杂种细胞生长的培养基中，挑选有各种遗传缺陷(如其它酶缺乏，药物敏感性等)的骨髓瘤细胞也是有可能的。在杂种瘤细胞系的无性繁殖和挑选时，应用高分辨的检测方法有助于选择具有所需特异性的单克隆抗体。可用几种标准分析法之任何一种，来检测能产生抗体的杂种细胞，这些方法包括酶联免疫测定法和放射免疫测定法。免疫组织法也可用于抗体测定和选择，最佳测定法是应用放射性碘标记的oFSH的双抗体放射免疫测定法，已经证明其它分析方法会导致假阳性结果。一旦选择了所需融合的细胞杂种，并无性繁殖成为产生抗体的细胞系，则每个细胞系可以两种标准方法之任一种进行繁殖。杂种瘤的试样可注入组织相容的动物体内，该动物能提供最初融合的体细胞和骨髓瘤细胞。注射后，动物生出瘤，该瘤分泌出由融合细胞杂种产生的特异单克隆抗体。该动物的体液，如血清或腹水可穿刺放液，以提供高浓度单克隆抗体。另外，每个细胞系可在实验室培养皿中作体外繁殖。通过滗析、过滤或离心可获得含有高浓度单一特异性单克隆抗体的培养基。本专利技术的目的之二是提供一种能产生抗促卵泡激素的单克隆抗体的连续细胞系，其中包括由能产生抗促卵泡激素抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合而形的杂种瘤细胞。最好通过NS-I骨髓瘤细胞与用促卵泡激素免疫的BALB/C小鼠体中得到的脾B细胞融合，形成杂种瘤细胞系，羊促卵泡激素(oFSH)制剂可用来使上述小鼠免疫。用由羔羊或猪垂体腺提取的FSH与佐剂的混合物，使小鼠免疫。杂种瘤细胞系生长于营养溶液组织培养基中。当通过稀释克隆反复地进行组织培养后分析纯度时，该细胞系给出以100%频率产生FSH特异克隆的抗体。有意义的是杂种瘤细胞可稀释克隆，以确保单细胞系的选择。杂种瘤细胞至少可稀释克隆4次，杂种瘤细胞系的具体实例是标记为BFR87-70和BFR87-124的细胞系，培养它们对抗羊FSH。上述试样保存于Bunge(Australia)Pty.Ltd.CellCollectionat89FlemingtonRoad，NorthMelbourne，Australia。本文所述的专利技术并不局限于列举的杂种瘤细胞系范围，由于这些实施例旨在说明本专利技术的一种目的，因此，产生功能上相当的单克隆抗体的任何等效细胞系均在本专利技术范围内。下述杂种瘤细胞系试样已保藏在欧洲动物的细胞培养物收藏中心(ECACC)。培养物保藏号BFR87-70BFR87-124本专利技术目的之三是提供一种抗促卵泡激素的单克隆抗体，该单克隆抗体是由能产生抗FSH的单克隆抗体的连续细胞系产生的，其中包括能产生抗促卵泡激素抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂种瘤。可由如上所述的杂种瘤细胞系产生单克隆抗体。单克隆抗体的具体实例包括那些由杂种瘤细胞系标记为BFR87-70和BFR87-124形成的抗体，该细胞系的培养是为抗羊FSH。其样品保藏在CellCollectionfacilityofBunge(Australia)Pty.Ltd.at89FlemingtonRoad，NorthMelbourne，Australia。本专利技术目的之四是提供一种纯化促卵泡激本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗促卵泡激素（ＦＳＨ）的单克隆抗体的制备方法，该方法包括：提供一种能产生抗ＦＳＨ抗体的Ｂ细胞和一种骨髓瘤细胞；使Ｂ细胞与骨髓瘤细胞融合；并繁殖融合生成的杂种瘤细胞；以及采集所述杂种瘤细胞产生的抗体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：罗德尼约翰菲德斯，
申请(专利权)人：邦奇澳大利亚有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]