重组日本脑炎分子及其使用方法技术

本发明专利技术提供了重组日本脑炎ＤＮＡ分子，载体和由它们生产的重组蛋白质。本发明专利技术还提供检测、免疫和治疗感染日本脑炎的对象的方法，该方法包括在合适条件下使用重组日本脑炎蛋白质。（*该技术在2010年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
东方国家发生脑炎的主要原因是由于日本脑炎病毒(JEV)，一种黄色病毒感染的结果。该病毒是以当地稻田滋生的蚊子为媒介传播的。直至最近，唯一普遍公认的有效的黄色病毒疫苗是减毒的黄色发热病毒疫苗(Thieler et al)试图生产用于其它黄色病毒的减毒疫苗，大多数只取得有限成功(Bancroft et al.;Innis et al.)。自1965年以来，一直使用高度纯化的、福尔马林失活的、来源于小鼠脑的JEV疫苗，事实表明，该疫苗安全而且有效(Hoke et al)。对高度纯化的需求通常意味着成本比较高。因此，希望有一种不从小鼠脑得到的疫苗(Monath，Editorial，NEJM，8 Sept，1988)。期望通过采用重组DNA技术，能生产这类疫苗。本专利技术目的之一在于提供一种重组日本脑炎分子，该分子能用于检测JEV感染，对JEV的感染免疫以及治疗JEV感染。本专利技术另一个目的在于提供检测受试者的日本脑炎感染的方法。本专利技术目的还在于提供一种安全而有效的疫苗，该疫苗能以较低的成本制造。本专利技术提供重组日本脑炎DNA分子，载体及由它们产生的重组旦白质。本专利技术还提供了检测，免疫和治疗受试者的日本脑炎感染的方法，包括在适当的条件下利用重组日本脑炎旦白质。附图说明图1表示JEV的限制性内切酶图谱;图2说明重组JEV病毒载体的克隆过程;图3表示通过重组产生的蛋白质与JEV抗体的反应;图4表示接受了杆状病毒表达的、JEV多旦白或E糖旦白的小鼠的存活情况;图5表示噬菌斑试验结果，其中可看到在接受重组JEV E旦白的小鼠中JEV特异性噬菌斑减少;图6表示免疫沉淀分析结果;图7概述了JEV质粒重组体的结构;图8表示重组旦白质的Western印迹分析。通过与JEV E特异性单克隆抗体反应测定载体8283表达的一种旦白质。该结果表明表达是通过pM和M基因进行的。Western印迹还显示了强度大致相同的三个多肽两条接近的附加带在约45K，另一条带在约65K。这个结果表明45K的二条带代表E-基因产物，它是由预定大小为66-72K的pM/M/E前体分裂产生的。Western吸印试验测定结果表明，重组载体8302没有显示E特异性抗体;图9表示与抗-NS-1单克隆抗体反应的重组旦白质的Western印迹;图10表示与抗-M和抗-E特异性抗体反应的重组体的Western印迹;图11表示抗JE-E HMAF只与JE-E表达重组体反应，而DEN1-E HMAF特异性地与DEN 1-E表达重组体反应;图12表明NS-1表达重组体具有可测量程度的交叉反应性;图13表示某些重组载体产生全长度NS-1基因产物。本专利技术提供一种重组DNA分子，它包含全长或部分JEV被膜蛋白编码区。本专利技术还提供一种重组DNA载体构建物，它包含全长或部分JEV被膜蛋白编码区和一种病毒载体。在本专利技术的一个实施方案中，该病毒载体是一种杆状病毒载体。该杆状病毒载体含有ATG起始密码子、一个疏水膜插入(信号)序列和一个TAA转译终止密码子。可用于实施本专利技术的合适载体包括(但不限于这些)，选自命名为MGS3+1、PUC19、MGS12、MGS3和MGS3+2的这组载体的杆状载体。本专利技术还提供了重组JEV病毒载体，例如命名为8302、8437、8501、8929、8469、8468、8650、8590和8716的载体，以及重组JEV RNA和它们各自表达的被膜蛋白。本专利技术还提供了一种昆虫细胞，该细胞含有一种重组DNA分子，该分子包含全长或部分JEV被膜旦白编码区。本专利技术还提供了一种组合物，该组合物含有旦白质和一种医药上可接受的载体，该旦白质由命名为8302、8437、8501、8929、8469、8468、8650、8590和8716的重组载体表达。这里所用的术语“医药上可接受的载体”包括任一种标准药用载体，如磷酸盐缓冲的盐水溶液，水和乳状液如，油/水乳液和各种类型的润湿剂。这些组合物也可含有一种合适的辅药。本专利技术提供的上述组合物中还包括与重组JEV被膜旦白质相结合的可检测成分，如，放射性同位素如32P和35S，染料和光化学试剂。本专利技术提供了一种检测受试者(如病人)中存在的日本脑炎病毒的方法，该方法包括在生成抗体-抗原复合体的条件下，将来自试验对象的合适样品与上述重组JEV被膜旦白相接触，检测生成的复合体，从而可检测日本脑炎的存在。在本专利技术的一个实施方案中，该重组JEV被膜旦白质是用上述可检测成分标记的。用于实施本专利技术的合适样品包括(但不限于这些)血清;中枢神经系统组织;和脊髓液。本专利技术为日本脑炎患者(如病人)提供了治疗和/或预防方法，该方法包括给患者施用可接受治疗量的所说的JEV被膜旦白组合物，可有效地防止和/或治疗日本脑炎。该组合物可用任何合适的方法给药，如静脉注射或肌内注射。JEV的CDNA克隆按前述McAda等人，Mason等人的方法克隆日本脑炎病毒(Nakayama株)且进行序列分析。选择包含编码E(pE-7)，NSI(pM-6)或该病毒的全部多旦白的编码区的克隆。杆状病毒的克隆和表达图7概述了质粒JEV重组体的结构。E糖旦白编码区来源于通过用HpaⅡ和EcoRⅠ限制性消化克隆pM-7(Y1)而产生的核苷酸656-1919的一个1263碱基对(BP)片段(参见图1)。NS1糖旦白编码区来源于克隆PM-6，即用ApsⅠ切割后产生的核苷酸2063-3340的一个1277bp片段。称为“多旦白”的preM至E的JEV基因编码区是通过将在核苷酸1620处有一个共同SacⅠ限制性位点的克隆系Y1和pM-6融合而构建成的。然后将该基因克隆到杆状病毒重组载体(pAcMGs)。将E基因克隆到一种可提供一个起始ATG密码子、一个疏水膜插入(信号)序列和一个TAA转译终止密码子的载体上。将NS1和多蛋白基因克隆到一种载体上，由该载体提供ATG和终止密码子，但信号序列是由插入物供给的。用病毒和载体DNA共转染草地粘虫(Spodoptera frugiperda)昆虫细胞，将重组载体上的基因重组到杆状病毒(Autographa californica，核多角体病毒)的多角(Pn)基因(参见图2)。根据噬菌斑形态学可鉴定多角阴性(Pn-)重组体。为表达该JEV基因，以每细胞生成10个噬菌斑单位的多重性用重组病毒感染单层或悬浮培养物的昆虫细胞。感染后72小时，收集细胞，并在含SDS和2-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中溶解。在聚丙烯酰胺-SDS凝胶中电泳该溶胞产物，用考马斯(coomassie)蓝染色或转移到硝酸纤维膜上。用合适的抗血清通过Western吸印试验检测抗原带。鼠保护试验用生长6周的雌性C57黑鼠作为一个鼠免疫激发模型。将等体积未纯化的草地粘虫细胞溶胞物(约3.3×107细胞/ml)和弗氏完全佐剂混合制得免疫制剂作为第一次剂量;将上述溶胞产物与不完全佐剂混合制得免疫制剂作为依次的二次剂量。从腿部肌肉注入0.2ml该混合物，再由腹膜注入另外0.2ml没有佐剂的细胞溶胞产物。在0，3和14天对鼠接种，在第21天即它们被激发的前一天抽血。由感染日本脑炎病毒(Nakayama株)的乳鼠脑的20%悬浮液的1/10稀释液制备免疫激发病毒。该免疫激发制剂含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组ＤＮＡ分子，它包含全长或部分ＪＥＶ被膜旦白编码区。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：马克A科克伦，盖尔E史密夫，简A塔纳西，
申请(专利权)人：微基因系统公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]