人的碱性FGF突变蛋白质的制备制造技术

于此公开的是（１）一种含对一种突变蛋白质编码的核苷酸序列的载体，在该突变蛋白质中成人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）中的至少一种组分氨基酸被另一种氨基酸所取代，而Ｔ７启动子处于其上游端；（２）一种被（１）的载体转化的转化体；（３）制备突变蛋白质的方法，（４）（３）的方法，其中约３～５００μＭ的异丙基硫代吡喃型半乳糖苷（ＩＰＴＣ）按转化体的对数生长期加于培养基中，（５）（４）的方法，进一步包括纯化过程。（*该技术在2010年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于制备一种成人碱性成纤维细胞生长因子(下面简写成hbFGF)的突变蛋白质的技术，其中hbFGF的至少一种组分氨基酸被另一种氨基酸所取代，这种突变蛋白质可用作伤口愈合促进剂。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种多肽的激素，它具有大约17，000的分子量，且主要由脑下垂体分泌。bFGF最初是作为一种对成纤维细胞(如BALB/c3T3细胞)有很强的生长促进作用的因子而被分离出〔D.Gospodarowicz，Nature 249，123(1974)〕。人们已知FGF对几乎所有的来源于中胚层细胞都有生长促进作用〔D.Gospodarowicz et al.，Nature Cancer Insitute Monograph 48，109(1978)〕。尤其是bFGF生成血管的作用，连同其细胞生长促进作用都提出有将其用作创伤的治疗医药和用作血栓形成、动脉硬化等疾病的预防和治疗医药的可能性。对hbFGF编码的基因已由Abraham等人〔The EMBO Journal 5，2523～2528(1986)〕和Kurokawa等人〔FEBS Letters 213，189-194(1987)〕克隆化，并在动物细胞中表达〔The Journal of Biological Chemistry 263，16471-16478(1988)〕以及大肠杆菌中表达〔The Journal of Biological Chemistry 263，16297-16302(1988)〕。然而，该物质生产并不充足，且最终的样品太不稳定以至于不能用作医药。为解决不稳定性的各种研究结果已经发现对于hbFGF分子的半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代的这类化合物具有高的稳定性且表现出相同的生物活性(Biochemical and Biophsical Research Communication 151，701～708(1988)〕。进而，又已研究了一种制备一种突变蛋白质的方法，其中hbFGF的至少一种组分氨基酸通过遗传工程技术被另一种氨基酸所取代(见欧洲专利公开No.281，822)。当采用大肠杆菌制备重组蛋白质时，经常形成水不溶性内包体以累积蛋白质。当所需物质从这类内包体中分离出并纯化时，该内包体通常被所加入的蛋白质变性剂溶解。然而对于hbFGF突变蛋白质，如此溶解的这种蛋白质是失活的，目前还没有研究出使其再活化的技术。如果使用遗传工程技术，这种突变蛋白质可以大量累积并处于活化状态，进而可高产率地分离并提纯，则hbFGF突变蛋白质可以用作医药。因而，一个关键问题就是建立一种高产率制备这种突变蛋白质的方法。通常，当采用遗传工程技术制备大量基因产物时，则选择寄主载体体系和启动子是重要的，这种不同的选择取决于各自基因。各种对于hbFGF突变蛋白质的有效表达体系的研究结果已揭示出采用T7启动子的一种大肠杆菌基因表达体系〔F.M.Studier et al.，Journal of Molecular Biology 189，113-130(1986)〕是表达hbFGF突变蛋白质基因极好体系。T7启动子和hbFGF突变蛋白质基因的组合是新颖的。这种T7启动子被认为是一种强启动子。然而在某些情况下，这种累积的蛋白质(如人体内白细胞素-2、促乳素)形成内包体，并且其大多数都是以失活态累积的。本专利技术者已发现内白细胞素的例子，Paris，N.等人已发现促乳素例子〔Paris，N.et al，Biotechnology and Applied Biochemistry，12，436-449(1990)〕。本专利技术者对于积累大量的、处于活性状态的hbFGF蛋白质进行了深入研究，目前已发现加入低浓度的异丙基硫代吡喃型半乳糖苷是有效的。此外，本专利技术者进而还建立一种有效地分离和纯化hbFGF蛋白质的方法，这样完成了本专利技术。本专利技术提供(1)含有对一种突变蛋白质编码的核苷酸序列的载体，在这种突变蛋白质中，成人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的至少一种组分氨基酸被另一种氨基酸所取代，而T7启动子在其上游端;(2)一种由上述(1)中所述载体转化来的转化体;(3)上述(2)中所述的转化体，其中寄主是具有一个处于lac启动子下游端的T7RNA聚合酶基因;(4)一种制备突变蛋白质的方法，该突变蛋白质中成熟hbFGF的至少一种组分氨基酸被另一种氨基酸所取代，这种方法包括在培养基中培养上述(2)中所述的转化体;(5)上述(4)中所述的方法，其中，大约3～500μM(毫摩尔)的异丙基硫代吡喃型半乳糖苷(下面简写为IPTG)在上述(3)所述转化体的对数生长期内加入到培养基中，接着进行培养;以及(6)上述(5)中所述的方法，其中含有突变蛋白质产物的溶液使用色谱法进行纯化，并采用交联多糖硫酸盐、具有磺酸基团作为交换基团的合成聚合物和/或用于凝胶过滤的合成聚合物作为载体。根据本专利技术，取代型的成熟hbFGF突变蛋白质可以大量制备，因而本专利技术可用于工业化生产这种突变蛋白质。附图说明图1示出了实施例1中使用的rhbFGF突变蛋白质CS23的DNA核苷酸序列和核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列;图2是实施例1中得到的质粒pTB960的结构示意图;图3示出了实施例5中获得的纯化试样的SDS-pAGE图和标记;以及图4至图6给出了由实施例5中获得的纯化试样的高性能液相色谱图;图7至图9是由实施例8获得的质粒pHP901，pME901和pCM901的结构示意图。本专利技术的成熟的hbFGF是一种由146种氨基酸构成的肽，在图1中，将紧接于N-末端甲硫氨酸的氨基酸脯氨酸作为第一号，而将C-末端的丝氨酸作为第146号。于本专利技术中给出的hbFGF突变蛋白质的例子包括这类蛋白质，即成熟hbFGF的至少一组分氨基酸被另一种氨基酸所取代，如欧洲专利公开说明书No.281，822和Biochemical and Biophysical Research Communication 151，701-708(1988)〕中所述。至于此种突变蛋白质(其中hbFGF的至少一种氨基酸被另一种氨基酸所取代)在取代前hbFGF的组分氨基酸的数目，它可以是任何数量，只要不丧失FGF的特性(如血管形成特性、细胞生长刺激活性和细胞分化活性)。在取代前此组分氨基酸的例子包括半胱氨酸和与半胱氨酸不同的氨基酸。特别指出的是半胱氨酸是较佳的。除半胱基酸以外其他氨基酸在取代前作为组分氨基酸的包括天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸和缬氨酸。当取代前组分氨基酸是半胱氨酸时，中性氨基酸作为取代氨基酸是较佳的。中性氨基酸的具体例子包括甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸。尤其丝氨酸和苏氨酸是较佳的。当取代前组分氨基酸是除半胱氨酸以外的一种氨基酸时，选择在亲水性、疏水性和电荷不同于取代前此组分氨基酸的其他氨基酸作为取代氨基酸。特别是，取代前氨基酸是天冬氨酸时，取代氨基酸包括天冬酰胺、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和精氨酸，而天冬酰胺和精氨酸是较佳的。当取代前氨基酸是精氨酸时，取代氨基酸包括谷氨酰胺、苏氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有对一种突变蛋白质编码的核苷酸序列的载体，在该蛋白质中至少一种成人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）的组分氨基酸是被另一种氨基酸所取代，且Ｔ７启动子位于其上游端。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：北野一昭，栗山正人，西村纪，五十岚贡一，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]