酶促制备成纤维细胞生长因子的方法技术

公开了制备ｂＦＧＦ的方法，其包括：（ｉ）使肝素或硫酸肝素与具有９－１０Ｌｅｕ－Ｐｒｏ键的ｂＦＧＦ间形成加合物；（ｉｉ）用胃蛋白酶Ａ或组织蛋白酶Ｄ处理该加合物，以裂解所说的键；以及（ｉｉｉ）由加合物中释放出如此得到的ｂＦＧＦ。该方法可用于由较长形式的ｂＦＧＦ制备１４６个氨基酸形式的ｂＦＧＦ。其也可用于由ｂＦＧＦ的混合物中产生单一形式的ｂＦＧＦ，所说ｂＦＧＦ混合物中各ｂＦＧＦ之氨基酸序列的差异仅在于它们具有不同的Ｎ末端。（*该技术在2011年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的酶促制备方法。bFGF最初是作为146个氨基酸的多肽从脑和脑垂体中分离的(Esch et al.，PNAS USA 82，6507-6511，1985)。已克隆了牛bFGF的基因(Abraham et al.，Science，233，545-548，1986)。据核苷酸序列可推测出一个155氨基酸的bFGF转译产物。进一步的工作表明，在加入酶抑制物后可从正常脑垂体组织中连同146氨基酸bFGF一起分离到154氨基酸bFGF(Ueno et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.138，580-588，1986)而且脑和肝癌细胞中的酸性蛋白酶可裂解bFGF(Klagsbrun et al.，PNAS USA 84，1839-1843，1987)。使用蛋白质工程技术有可能得到用于治疗目的的重组生长因子。然而，一旦这些生长因子得以表达，即可被加工成不同形式的混合物。在这方面，FGF也不例外(Barr et al，J.Biol.Chem.263，31，16471-16478，1988)。我们现已设计了一种制备其末端被截短之bFGF的方法。可用该方法由更长形式的bFGF制得146氨基酸形式的bFGF，并由bFGF的混合物中产生出单一形式的bFGF。所得产物是纯的且不掺杂其他形式的bFGF。因此，本专利技术提供了一种制备bFGF的方法，该方法包括(ⅰ)使肝素或硫酸肝素与具有9-10Leu-Pro键的bFGF间形成加合物;(ⅱ)用胃蛋白酶A或组织蛋白酶D处理该加合物，以裂解所说的键;以及(ⅲ)由加合物中释放出如此制得的bFGF。步骤(ⅰ)中可利用各自有9-10Leu-Pro键、从位置11到其各C末端有相同的氨基酸序列、且具有不同的N末端氨基酸序列的2种或多种bFGF的混合物。它们的氨基酸序列可只因有不同的N末端而有所差异。典型情况下，bFGF序列之间仅有的差异是N末端氨基酸残基的数目不同。一种bFGF不能比另一种bFGF多有一个或几个N末端氨基酸残基。另外，各bFGF间可能在第9位氨基酸之前的N末端序列中包含不同的残基。因此，本专利技术方法有可能适用于任何下述bFGF的混合物，即混合物中各bFGF的氨基酸序列均以序列编号小于9的N末端氨基酸残基开始，且各bFGF具有不同的N末端。因此，应用于步骤(ⅰ)的混合物可由具有下列通式的bFGF组成NH2-(AA)x-Leu-Pro-Y-COOH其中AA是任何氨基酸残基，X是0或正整数，Y代表(11-155)bFGF的氨基酸序列。全长bFGF具有155个氨基酸残基并可定名为155-bFGF或(1-155)bFGF。人(1-155)bFGF的氨基酸序列示于SEQIDNO1中。因此本专利技术可应用于(1-155)bFGF至(8-155)bFGF之一或其中两种或多种的混合物，此时上述通式中的X分别是8至1的正整数，且(AA)x代表SEQ IDNOS2-6中之一所述的序列、IleThrThr、ThrThr或Thr。特别是，本专利技术可适用于154氨基酸残基bFGF〔(2-155)bFGF〕和153氨基酸残基bFGF〔(3-155)bFGF〕的混合物。通常可用DNA重组技术制得bFGF或bFGF的混合物。在这样的混合物中，因为在其N末端加工各转译产物，故可得到不同形式的bFGF。所有的或各bFGF均可以是人、小鼠或啮齿动物bFGF。可按常规方法在选自肝素和硫酸肝素的bFGF保护剂与bFGF之混合物间形成加合物。保护剂和bFGF大多都是以水溶液形式提供的。该溶液可以是经过缓冲的。可以加入二硫苏糖醇等抗氧化剂以防止蛋白质氧化。bFGF保护剂的比例可以是从0.5∶1到10∶1(W/W)，如1∶1到5∶1(W/W)。作为加合物来保护bFGF，可防止在加入胃蛋白酶A时使之遭受进一步的水解。然后是使胃蛋白酶A(EC3.4.23.1)或组织蛋白酶D(EC3.4.23.5)与加合物接触，从而特异地裂解包含在加合物中之bFGF的9-10Leu-Pro键。可在加合物的溶液中提供酶，因此可将酶加到bFGF和保护剂内。一般酶是在调到PH4～6的溶液中提供的。如在使用胃蛋白酶A的情况下，可将溶液保温30分钟至10小时，例如1至8小时。如使用组织蛋白酶，一般保温时间更长达90至130小时，较好为大约110小时。保温温度可从5℃至室温，例如10℃左右。保温直到反应完成为止。另外，可将保护剂固定在载体上制成亲和柱。可使用任何一种适当的载体，如琼脂糖凝胶或交联的葡聚糖凝胶珠(例如Sepharose)。将bFGF的溶液加到柱上。bFGF与保护剂结合并保留在柱上。然后使酶溶液通过柱。最后，可从柱上洗脱被截短的单一形式的bFGF。此可用氯化钠水溶液的线性梯度来完成。可按本专利技术的方法得到纯的bFGF，特别是可得到称为(10-155)bFGF的146氨基酸形式的bFGF。例如可用如此得到的bFGF治疗创伤和烧伤。可作为任何适当的配制品将bFGF应用于创伤或烧伤。因此这样的配制品可另外含有生理上可接受的载体或稀释剂。提供下列实施例(包括制备实施例和比较实施例)进一步阐述本专利技术。制备实施例制备154/153形式的bFGF按照欧洲专利申请EP-A-363675中所述的方法构建bFGF的合成DNA序列和携带这一序列的表达质粒。所用发酵和纯化方法如下所述(a)发酵方法用携带编码bFGF之人基因和四环素抗性基因的质粒转化得自Institute Pasteur collection的B型大肠杆菌菌株。使用该转化菌株来生产重组的非糖基化h-bFGF(人bFGF)。制备该菌株的主细胞库(15个冻干管)和工作细胞库(W.C.B.)(70个储存于-190℃液氮中的管)。用一管W.C.B作为发酵阶段的接种物。发酵过程在装有4升培养基的10升发酵罐内进行。向培养基内加入盐酸四环素以维持菌株选择条件。37℃发酵20小时后，最终生物量干重为42±Zg/L，以比较凝胶电泳法测得bFGF产率为2500±500mg/L。为了使细菌生长良好，发酵期间须供入纯氧。(b)初步纯化以离心法由总发酵液中分离细胞(微生物)。将所得沉淀物重新悬浮于含氯化钠的磷酸钠缓冲液中。为有效地破碎细胞，须使之至少三次通过高压匀浆器。离心澄清所得溶胞产物，收集上清作进一步的处理。(c)纯化将澄清的上清液加到Sepharose(商品名)SFast Flow(阳离子交换剂)柱上，并使用磷酸盐缓冲液中渐增氯化钠浓度的梯度由柱上洗脱产物。然后在用磷酸盐缓冲液中渐增的氯化钠浓度梯度洗脱的肝素-Sepharose 6B柱上进一步纯化该产物。最后在Sephadex(商品名)G25树脂柱上进行缓冲液交换，得到溶于大量产物缓冲液(磷酸钠-EDTA)中的产物。(d)柱消毒经用氢氧化钠溶液洗涤来消毒Sepharose S Fast Flow和Sephadex G25柱。另外可用PH8.5和PH5.5的含3M氯化钠的溶液洗肝素-Sepharose。以这种方式得到154/153形式的bFGF。亦即得到含下列组分的约50∶50混合物具有155个氨基酸的氨基酸序列的154氨基酸人bFGF〔(2-155)本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）的方法，其包括：（ｉ）使肝素或硫酸肝素与具有９—１０Ｌｅｕ—Ｐｒｏ链的ｂＦＧＦ之间形成加合物；（ｉｉ）用胃蛋白酶Ａ或组织蛋白酶Ｄ处理该加合物，以裂解所说的键；以及（ｉｉｉ）由加合物中释放出如 此得到的ｂＦＧＦ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：P蒙森，F保罗，D贝特贝德，P萨密托斯，
申请(专利权)人：法米塔利亚卡洛埃巴有限责任公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]