三精氨酸胰岛素制造技术

本发明专利技术涉及人胰岛素类似物（三精氨酸胰岛素），包括两种制备三精氨酸胰岛素的酶方法。这些化合物在ｐＨ达６．１时仍可配制成可溶性制剂，并具有长效降血糖活性。三精氨酸胰岛素具有天然人胰岛素的基本结构加上三个额外的精氨酸残基。其中的二个额外精氨酸残基串联位于胰岛素Ｂ链的羧基末端，第三个精氨酸残基位于胰岛素Ａ链的氨基末端。在Ｂ３、Ｂ１０和Ａ２１位上具有某些氨基酸置换的三精氨酸胰岛素类似物也包括在本发明专利技术内。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于临床医学领域，提供了用于糖尿病治疗的新的胰岛素形式。目前，糖尿病的主要治疗方法涉及用中效和长效胰岛素制品进行治疗。设计这些制剂是为了控制病人整个夜间的葡萄糖水平，同时给许多病人提供每天注射一次的治疗。所有这些制剂的共同特点在于，它们都是胰岛素的不溶性悬浮液。因此，注射剂量可能有很大变化，并且，在皮下注射之后，葡萄糖的控制可能受影响(Skyler，J.S.，MedicalClinicsofNorthAmerica，721337-1354，1988)。许多这种制剂还需要加入大量的鱼精蛋白以提供长时间作用，鱼精蛋白是一种鱼蛋白质，已经证明它能在一些病人体内引起抗体产生(Ellerhorst，J.A.等，TheAmericanJournaloftheMedicalSciences，299298-301，1987)。随着重组DNA技术的出现，已经合成了大量能在制剂中完全保持可溶性的胰岛素类似物，它们比天然胰岛素有着更快或者更长的作用(Markussen，J.等，ProteinEngineering，1215-223，1987)。对于得到更为长效的胰岛素类似物而言，一个最有希望的方法是将它们配制成在低pH(pH3-4)条件下完全可溶的制剂。在皮下注射后，由于迅速调整到机体内环境的天然pH值(pH7.4)，使这些类似物沉淀或结晶。它们在pH7.4条件下缓慢地重新溶解，使作用时间达到所需的延长。在上述方法中存在下面两个问题。首先，长期施用酸性很强的溶液会引起疼痛、皮肤坏死和腐肉形成(DeLuca，P.P.和Rapp，R.P.PharmaceuticsandPharmacyPractice;Banker，G.S.和Chalmers，R.K.编;238-278，1982，J.B.LippencottCo.，Philadelphia，PA)。从这一点考虑，更接近中性的溶液(pH6-7)显然更为理想。其次，因为胰岛素类似物对机体来说是非天然的，所以机体会将它们视为异己，产生针对这些胰岛素类似物的抗体，从而干扰病人的胰岛素疗法或引起其它问题(Patterson，R.等，AnnalsofAllergy，64459-462，1990)。尽可能减少这类蛋白质结构的变异可能会避免这一潜在的问题。已有人描述了一种称为二精氨酸胰岛素的胰岛素类似物，它具有中效作用以及在pH4-5易于溶解的特点(Zeuzem，S.等，Diabetologia，3365-71，1990)。但是二精氨酸胰岛素缺乏本专利技术的优点之一，即在pH6附近可溶。本专利技术还显示出了优于二精氨酸胰岛素的长效作用特点。除了前文提及的强酸性制剂的生理性问题外，天然胰岛素样分子在低pH条件下还存在另一个问题。在酸性条件下，A链第21位(A21)上的天冬酰胺残基非常易于发生脱酰胺作用和其它副反应，从而形成不希望有的二聚体和多聚体(Markussen，J.等，ProteinEngineering，2157-166，1988)。这些反应最好在低于pH4的条件下进行，而在大于pH5的条件下几乎不存在(引文同前)。因此，在进行人体治疗方面，最希望制备一种具有长效降血糖作用、低免疫原性且在高于pH6的条件下其制剂可溶的胰岛素样分子。本专利技术是基于以下发现本文称作三精氨酸胰岛素和三精氨酸胰岛素类似物的一些胰岛素类似物，具有附加了三个额外精氨酸残基的胰岛素天然结构，在动物模型中具有长效降血糖活性，并在pH达到6.1时仍能配制成溶液。本专利技术涉及具有下式的化合物或其可药用无毒盐 其中X和Z选自Ala、Arg、Asx、Cys、Glx、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，Y选自His、Asp或Glu。最优选的化合物是那些在可变位置上含有天然存在的氨基酸的化合物，即其中的X是Asn，Y是His，Z是Asn。本专利技术还包括由人胰岛素原组成的断裂(64)胰岛素原三精氨酸类似物或其可药用盐，其中B链第3位残基(B3)和A链第21位残基(A21)选自Ala、Arg、Asx、Cys、Glx、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val;B链第10位残基(B10)选自His、Asp或Glu;C肽第64位残基(Lys-64)与C肽第65位残基(Arg65)之间的酰胺键(肽键)被打开。在进一步的实施方案中，本专利技术包括由去掉了Lys-64的断裂(64)胰岛素原三精氨酸类似物组成的去(64)胰岛素原三精氨酸类似物或其可药用盐。最优选的化合物是在可变位置上含有天然存在的氨基酸的化合物，即其中的B3和A21残基是Asn，B10残基是His。本专利技术的另外一个实施方案是制备人三精氨酸胰岛素的方法，该方法包括a)使人胰岛素原与胰蛋白酶和羧肽酶B接触，产生去(64)人胰岛素原;b)分离去(64)人胰岛素原;c)使去(64)人胰岛素原与胰蛋白酶接触;d)分离三精氨酸胰岛素。本专利技术另外一个实施方案是制备人三精氨酸胰岛素的方法，该方法包括a)在优先打开人胰岛素原Lys-64和Arg-65之间肽键的条件下，使人胰岛素原与赖氨酸内肽酶接触，产生断裂(64)人胰岛素原;b)分离断裂(64)人胰岛素原;c)使断裂(64)人胰岛素原与胰蛋白酶接触;d)分离人三精氨酸胰岛素。附图说明图1说明三精氨酸胰岛素和三精氨酸胰岛素类似物的一级氨基酸顺序，并显示出三个二硫键。每一个残基下面的数字对应于该残基在顺序中从氨基末端算起的位置。B链第3位上的符号X代表20种天然存在的氨基酸中的任何一种。B链第10位上的符号Y代表His、Asp或Glu，A链羧基末端的符号Z代表20种天然存在的氨基酸中的任何一种。图2显示人胰岛素原的一级氨基酸顺序。以黑色显示的残基表示天然人胰岛素，以白色显示的残基表示天然人胰岛素原的连接肽(C肽)。为了本文表述方便起见，常见于天然存在蛋白质中的20种L-氨基酸用标准的三字母缩写形式表示(参见《CodeofFederalRegulations》第37卷第1.822节)。同样为了本文表述方便起见，一些术语按下列定义使用。术语“三精氨酸胰岛素”定义为在B链的羧基末端含有两个额外精氨酸残基(如图1和图2所示的Arg-31和Arg-32)，在A链的氨基末端含有一个额外精氨酸残基(如图1所示的A链Arg-0或如图2所示的Arg-65)的人胰岛素。术语“三精氨酸胰岛素类似物”定义为三精氨酸胰岛素中B3或A21位或这两个位置被20种天然存在氨基酸中的任意一种所置换，而B10位可以被His、Asp或Glu置换。术语“胰岛素原三精氨酸类似物”指的是在B3、B10和A21位上含有与本专利技术一致的任何可能置换的人胰岛素原。术语“断裂(64)胰岛素原”定义为Lys-64和Arg-65(A链Arg-O)间的肽键被打开(见图1和图2)的人胰岛素原。术语“断裂(64)胰岛素原三精氨酸类似物”定义为在B3、B10或A21位上发生了与本专利技术一致的一个或更多个氨基酸置换的断裂(64)胰岛素原。术语“去(64)胰岛素原”定义为去掉了Lys-64的断裂(64)胰岛素原(见图1和图2)。术语“去(64)胰岛素原三精氨酸类似物”定义为在B3、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备下式的三精氨酸胰岛素类似物的方法：＊＊＊其中，Ｘ和Ｚ选自Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｘ、Ｃｙｓ、Ｇｌｘ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ或Ｖａｌ，Ｙ选自Ｈｉｓ、Ａｓｐ或Ｇｌｕ，其中所说化合物由方法（Ａ）或（Ｂ）制备：（Ａ）ｉ）用胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ与人胰岛素原三精氨酸类似物接触，生成去（６４）人胰岛素原三精氨酸类似物；ｉｉ）分离去（６４）人胰岛素原三精氨酸类似物；ｉｉｉ）用胰蛋白酶与去（６４）人胰岛素原三精氨酸类似物接触；ｉｖ）分离三精氨酸胰岛素类似物；（Ｂ）ｉ）在优先断裂人胰岛素原三精氨酸类似物Ｌｙｓ－６４和Ａｒｇ－６５间肽键的条件下，用赖氨酸内肽酶与人胰岛素原三精氨酸类似物接触，生成断裂（６４）人胰岛素原三精氨酸类似物；ｉ）分离断裂（６４）人胰岛素原三精氨酸类似物；ｉｉｉ）用胰蛋白酶与断裂（６４）人胰岛素原三精氨酸类似物接触；ｉｖ）分离人三精氨酸胰岛素类似物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：JA霍夫曼，PK兰布伊，
申请(专利权)人：伊莱利利公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]