肿瘤坏死因子突变蛋白制造技术

本发明专利技术涉及对人ｐ５５肿瘤坏死因子受体具有选择性结合亲和性的人肿瘤坏死因子突变蛋白或其可药用盐，其特征在于，人肿瘤坏死因子的氨基酸顺序至少在８６位上有变化，由苏氨酸代替了丝氨酸残基。本发明专利技术还涉及编码该突变蛋白的ＤＮＡ顺序、包含该ＤＮＡ顺序的载体、由该载体转化的宿主细胞、由该宿主细胞产生上述突变蛋白的方法、含有该突变蛋白的药物组合物，以及该突变蛋白在疾病治疗中的应用。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
肿瘤坏死因子，更具体地说，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，是一种主要由受刺激的巨噬细胞产生的细胞素，它不仅对各种肿瘤细胞显示出显著的细胞毒性(Carswell等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 723666-3670，1975)，而且在炎症和免疫反应中起多种介导物的作用(综述见Beutler和Cerami，Ann.Rev.Immunol.7625-655，1989;Bonavista和Granger编“肿瘤坏死因子结构、作用机理、以及在疾病和治疗中的作用”，Karger，Basel，1990)。已经从大肠杆菌中克隆和表达的cDNA的核苷酸顺序，推导出了人肿瘤坏死因子α-(hTNF-α)的一级结构(Pennica等，Nature 312724-729，1984;Marmenout等，Europ.J.Biochem.152515-522，1985;Wang等，Science 228149-154，1985;Shirai等，Nature 313803-806，1985)。已发现hTNF-α和人淋巴细胞毒素的氨基酸顺序有显著的同源性(30%)。人淋巴细胞毒素常被称作人肿瘤坏死因子β(hTNF-β)，是一种主要由淋巴细胞产生的细胞素(Gray等，Nature 312721-724，1984;Fiers等，Cold Spring Harbour Symp.51587-595，1986)。本领域内还曾描述了氨基酸顺序经过修饰的hTNF-α，即所谓的TNF-α突变蛋白(例如见Yamagishi等，Protein Engineering3713-719，1990;或Fiers在Aggarwal和Vilcek编的“肿瘤坏死因子结构、功能和作用机理”一书中的文章，Marcel Dekker，Inc.，New York，印刷中;或Fiers等人在Bonavista和Granger编的书中第77-81页的文章(同上))。此外，TNF-α突变蛋白也曾是许多专利申请的主题，例如国际专利申请公开WO 86/02381、WO 86/04606、WO 88/06625;欧洲专利申请公开155，549;158，286;168，214;251，037和340，333;以及德国公开说明书3843534。本领域中还曾公开了淋巴细胞毒素的突变蛋白，例如见欧洲专利申请公开250，000;314094和336，383。TNF的生物学效应是通过两种特异性受体介导的，一种受体经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的表观分子量为55kD(p55-TNF-R)，另一种受体经SDS-PAGE测定的表观分子量为75kD(p75-TNF-R)。这两种形式的TNF受体都已被克隆，具体地说，p55-TNF-R已由Loetscher等人克隆(Cell 61351-359，1990)，p75-TNF-R已由(例如)Dembic等人克隆(Cytokine 253-58，1990)(关于这两种受体还可参阅欧洲专利申请90116707.2)。最近发现，两种受体都不仅与TNF-α结合，而且还以高亲和性与TNF-β结合(Sch nfeld等，J.Biol.Chem.2663863-3869，1991)。本领域公知，根据TNF-α的生物活性，它可能是治疗各种疾病的一种有价值的化合物。例如，单独应用TNF-α或与干扰素合并应用，都可能是一种有效的抗肿瘤剂(Brouckaert等，Int.J.Cancer 38763-769，1986)。然而，其全身性毒性是更广泛的治疗性应用的主要限制(Taguchi T.和Sohmura Y.，Biotherapy 3177-186，1991)。现已证明，在小鼠中，只与较小的小鼠TNF受体(鼠p55-TNF-R)结合的人TNF-α(hTNF-α)，其毒性比既与p55-TNF-R又与p75-TNF-R结合的鼠TNF-α(mTNF-α)要小得多。例如，在C57B16小鼠中，mTNF-α和hTNF-α的LD50分别约为10μg/小鼠和500μg/小鼠(Brouckaert等，Agents and Actions 26196-198，1989;Everaerdt，B.等，Biochem.Biophys.Res.Comm.163378-385，1989;Lewis，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 882830，1991)。因此，p75-TNF-R在全身性毒性中可能起特殊作用。hTNF-α和mTNF-α与人p55-TNF-R和人p75-TNF-R几乎同等地结合。然而，保留了通过hp55-TNF-R介导的生物活性，而又几乎完全丧失对hp75-TNF-R活性的hTNF-α突变蛋白，在鼠体系中的功能与hTNF-α等价，预计这些突变蛋白在灵长类中的全身性毒性较低。在欧洲专利申请公开486，908中，描述了与人p75-肿瘤坏死因子受体(hp75-TNF-R)和人p55-肿瘤坏死因子受体(hp55-TNF-R)的结合亲和力明显不同的人肿瘤坏死因子突变蛋白。现已发现，具有人肿瘤坏死因子的氨基酸顺序，但至少在86位有变化(由苏氨酸代替丝氨酸残基)的hTNF突变蛋白或其可药用盐，保留了与hp55-TNF-R结合的活性，但几乎完全丧失了与hp75-TNF-R结合的活性。另外，发现这些hTNF突变蛋白保留了通过hp55-TNF-R介导的生物活性，但却不再与hp75-TNF-R结合。然而，本专利技术的hTNF突变蛋白并不仅限于这种类型的突变蛋白。本专利技术还包括另一种类型的突变蛋白，这类突变蛋白仍然只与hp55-TNF-R结合，但却丧失了诱发功能性细胞反应的能力。因此，本专利技术提供了对人p55-肿瘤坏死因子受体(hp55-TNF-R)具有选择性结合亲和性的人肿瘤坏死因子突变蛋白或其可药用盐，其特征在于，人肿瘤坏死因子的氨基酸顺序至少在86位有变化，由苏氨酸代替了丝氨酸残基。如Pennica等人(同上)所公开的人TNF-α的氨基酸顺序如下1 10VAL ARG SER SER SER ARG THR PRO SER ASP LYS PRO VAL ALA HIS20 30VAL VAL ALA ASN PRO GLN ALA GLU GLY GLN LEU GLN TRP LEU ASN40ARG ARG ALA ASN ALA LEU LEU ALA ASN GLY VAL GLU LEU ARG ASP50 60ASN GLN LEU VAL VAL PRO SER GLU GLY LEU TYR LEU ILE TYR SER70GLN VAL LEU PHE LYS GLY GIN GLY CYS PRO SER THR HIS VAL LEU80 90LEU THR HIS THR ILE SER ARG ILE ALA VAL SER TYR GLN GHR LYS100VAL ASN LEU LEU SER ALA ILE LYS SER PRO CYS GIN ARG GLU THR110 120PRO GLU GLY ALA GLU ALA LYS PRO TRP TY本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对人ｐ５５－肿瘤坏死因子受体具有选择性结合亲和性的人肿瘤坏死因子突变蛋白或其可药用盐，其特征在于，人肿瘤坏死因子的氨基酸顺序至少在８６位上有变化，以苏氨酸代替了丝氨酸残基。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：W列斯劳尔，H勒舍，D施特伯，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]