用于生产γ－环糊精的环糊精糖基转移酶制造技术

本发明专利技术涉及环糊精糖基转移酶，该酶在将该粉或类似淀粉的物质转化为ＣＤ过程中使γ－ＣＤ含量提高，并且在第１８０位到第２４０位的氨基酸之间区域内该蛋白质序列含有氨基酸序列Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｘｘｘ Ａｓｐ＃渲械鞍字市蛄械牡冢蔽皇牵茫牵悦傅男藕烹牡起始点，并且Ｘｘｘ表示天然氨基酸。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于生产γ-环糊精的环糊精糖基转移酶(CGT酶)EC2.4.1.19，以及涉及这些酶的制备方法及它们的用途。通常，从淀粉或类似淀粉的物质制备环糊精。由环糊精糖基转移酶将淀粉酶促地转化为环糊精(CD)。不考虑该反应中使用的CGT酶，由于热力学原因，如果将反应进行达到热力学平衡(最高CD产生量)，淀粉主要转化为β-CD。但是，在起始阶段，在淀粉转化反应开始时，用于转化反应的酶不同，所得到的一级产物混合物中的组分也不同。就α-，β-或γ-CGT酶在起始阶段形成的主要产物α-，β-或γ-CD而言，三种酶之间也有明显的区别。至今，只在细菌中检测到适用于工业上生产CD的那些酶，并且已经使用至今，仅在软化芽孢杆菌(Bacillus macerans)(J.Bacteriol.(1986)，166，pp.1118-1122)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearochermophilus)(GB2169902)和催产克雷伯氏杆菌(Klebsiella oxytoca)(Gene(1986)47，pp.269-277)中鉴定到α-CGT酶。例如在环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1990)34，pp.229-230)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)(US-A 3，812，011)，Bacillus ohbensis(JP74124285)，微球菌各个种(Micrococcus sp.)(EP0017242)以及在尚未按分类学规则进行确切分类的嗜碱芽孢杆菌(alkalophilic bacilli)，如芽孢杆菌属38-2菌株(Bacillus sp.38-2)(J.Gen.Microbiol.(1988)134，pp.97-105)，17-1菌株(关于环糊精的第4届国际专题讨论会的记录汇编(1988)，pp.87-92)，1011菌株(Appl.Microbiol Biotechnol.(1987)26，pp.149-153)以及1-1菌杆(关于环糊精的第4届国际专题讨论会的记录汇编(1988)，pp.71-76)中鉴别出了β-CGT酶。已有人描述在枯草芽孢杆菌313(Bacillus subtilis313)(Agric.Biol.Chem(1986)50，pp.2161-2162)，芽孢杆菌属A1-6(Bacillus sp.A1-6)(J.Ferment Bioeng.(1990)70(3)，pp.150-154)以及芽孢杆菌属290-3(Bacillus sp.290-3)(关于环糊精的第4届国际专题讨论会记录汇编(1988)，pp.87-92)中存在有在起始阶段能形成γ-CD的高活性酶。X-射线结构分析阐明了环状芽孢杆菌的β-CGT酶的三维空间结构(J.Mol.Biol.(1990)217，pp.737-750)。从该结构可以推断出能够直接参与构建底物结合位点以及构建该CGT酶活性中心的氨基酸残基，但是不能推导出决定该CGT酶底物特异性的氨基酸残基(Biochemistry(1992)31，pp.8740-8746)。由于在工业上制备环糊精使用CGT酶将淀粉转化为环糊精时总是产生由几种环糊精组成的混合物，因而已经开发了各种用于分离纯化环糊精(α，β或γ)的方法-采用，例如基于环糊精分子量不同，用色谱的方法可从产物混合物中分离出限定的CD(例如在US-A4808232中描述)。-在用酶促方法将淀粉转化为环糊精时，加入复合物形成剂。该形成剂仅与一种限定的CD反应，从而例如，形成一种能通过物理方法从反应混合物中分离出来的一种不溶性复合物。随后，溶解该复合物，并且分离出匀质CD(例如由EP0291067描述)。-通过向反应混合物中加入一种有机溶剂，例如乙醇，使用γ-CGT酶时产品组分向γ-CD转变(J.Ferm.Bioeng.(1990)70(3)，pp.150-154)。在每种方法中，在最适条件下使用CGT酶，这样对于将要制备其纯化形式的CD而言，这些酶具有形成尽可能高产量的起始产品的优点。至今已知的α-和β-CGT酶的特异性适合于工业上制备相应的环糊精。相反，没有一种已知的γ-CGT酶具有允许产生相当量的γ-CD的产物特异性。因此，为了制备γ-CD，在JP-03 053892中建议通过加入γ-CD特异性复合物形成剂糖基甘草素，麦芽糖和一种CGT酶而将α-和/或β-环糊精酶促地转化为γ-CD。本专利技术目的是提供环糊精糖基转移酶(CGT酶)，该酶在将淀粉或类似淀粉的底物转化为CD时能在更大程度上产生γ-CD。本专利技术的另一目的是提供制备所述CGT酶的方法。本专利技术的再一目的是提供在所述CGT酶作用下制备γ-CD的方法。利用下面所述CGT酶可达到本专利技术的目的。在该酶的蛋白质序列第180位氨基酸和第240位氨基酸的区域内含有氨基酸序列Asn Leu Xxx Asp，其中该蛋白质序列的第1位是CGT酶信号肽的起始点，并且Xxx表示除Tyr外的天然氨基酸。优选的是，本专利技术的CGT酶在其蛋白质序列的第180位氨基酸和第240位氨基酸之间的区域内含有氨基酸序列Asn Leu Trp Asp或Asn Leu Ser Asp，其中该蛋白质序列的第1位是CGT酶的信号肽的起始点。特别优选的是，本专利技术的CGT酶在其蛋白质序列的第180位氨基酸和第240位氨基酸之间区域内含有Asn Leu Trp Asp序列基元，其中该蛋白质序列的第一位是CGT酶的信号肽的起始点。在转化淀粉或类似淀粉的物质时，本专利技术的CGT酶按下列所述产物分布产生CD，即γ-CD和α-CD与β-CD总和的商值大于用相应的未改变的起始酶转化淀粉获得的其产品的商值。在本文中，起始酶是指用于制备本专利技术所述的CGT酶的CGT酶。因此，令人意想不到的是，本专利技术的CGT酶比用于制备该酶的起始酶具有更高的γ-CD特异性。本专利技术的CGT酶的例子是由下表1所列的CGT酶通过用另一天然氨基酸取代每一例子中下面划线的Tyr而获得的CGT酶。用Trp或Ser替代Tyr的CGT酶是优选的。用Trp替代Tyr的CGT酶是特别优选的。表1CGT酶类型 来源的菌种 位置 氨基的序列β 环状芽孢杆菌 225 (1)β 芽孢杆菌1-1 213 (2)β B.ohbensis 213 (3)β 枯草芽孢杆菌 218 (4)γ 芽孢杆菌290-3 207 (5)(1)Tyr Lys Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp(2)Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp(3)Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp(4)Tyr Lys Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp(5)Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala ser对列举的这些CGT酶，表1示出了在β-和γ-CGT酶中普遍存在的氨基酶序列区域以及该序列区域内的Tyr，该序列区域与改变产品的特异性有关。在表1中，将在各种例子中重复产生的氨基酸序列的第一个氨基酸的编号规定为相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环糊精糖基转移酶（ＣＧＴ酶），该酶在将淀粉或类似淀粉物质转化为环糊精（ＣＤ）时使γ－ＣＤ的含量提高，并且在该酶蛋白质序列的第１８０位氨基酸至２４０位氨基酸之间的区域内含有ＡｓｎＬｅｕＸｘｘＡｓｐ氨基酸序列，其中该蛋白质序列的第１位是ＣＧＴ酶信号肽的起始点，Ｘｘｘ是指除Ｔｙｒ外的任何天然氨基酸。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：格奥尔格E舒尔茨，安东坎杜西奥，
申请(专利权)人：电化学工业有限公司国际，
类型：发明
国别省市：DE[德国]