哺乳动物细胞系和获得糖蛋白的方法技术

在无蛋白培养基中稳定地表达作为Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病素抗原的糖蛋白（ｇｐ）２５０（２２０）、糖蛋白（ｇｐ）３５０和／或杂交糖蛋白（ｇｐ）２５０（２２０）／（ｇｐ）３５０的哺乳动物细胞系，它是通过下述步骤得到的 （Ａ）从没有选择标记的仓鼠细胞系开始，该选择标记后来被按照（Ａ）（ｃ）所述方法进行染色体整合的载体表达，或被按照（Ｂ）所述方法进行染色体整合的载体表达， （ａ）在含血清培养基中培养细胞，并使它们附着在底物上或相互附着， （ｂ）重复更换部分被消耗的培养基，同时缓慢降低培养基的血清含量，最后对其进行无血清培养 －不主动地消除细胞的附着， －可选地，使细胞球形体形成或分开，分离分开的细胞球形体，在悬浮液中培养同时摇动，选择出在小团粒中生长的或单个生长的细胞 （ｃ）最后，使选择出的细胞经过如下处理步骤， （ｃａ）用表达上述糖蛋白（ｇｐ）的载体转染细胞系，其中，载体含有一种细胞系所没有的选择标记， （ｃｂ）培养细胞系，利用选择标记选择出一旦不再使用选择因子（抑制剂）就能稳定地表达糖蛋白的细胞，或者 （Ｂ）使哺乳动物细胞系首先经过处理步骤（Ａ）（ｃａ）和（Ａ）（ｃｂ），再经过处理步骤（Ａ）（ａ）至（Ａ）（ｂ）。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
Epstein—Barr病毒是引起人类传染性的单核细胞增多症的病原体，这种病是年轻人中最常见的传染病之一。90％以上的成人已受Epstein—Barr病毒感染。那些EBV阳性的人们以后可能发病如鼻炎癌、B细胞淋巴瘤，T细胞淋巴瘤，某些何杰金(Hodgkin)淋巴瘤，并且可能发生其它的恶性疾病。已经报道，在原发感染或后继阶段发生慢性形式，稀有病例中，发生急性致死形式。既然儿童中的Epstein—Barr病毒感染在临床上是难以察觉的，而且用表达Epstein—Barr病毒膜抗原gp250/350(BLLF—1阅读框，Baer等，1984)的重组疫苗病毒接种可以赋予对感染和/或疾病的抗性，必然假定，抵抗与Epstein—Barr病毒有关的疾病的疫苗是有可能的。由于活疫苗的可能的副作用，开发纯蛋白疫苗是一个重要目标。既然Epstein—Barr病毒膜蛋白gp 250/350(BLLF—1)是高度糖基化的，并且这种翻译后修饰是正确免疫原性的重要因素(Emini等，1988)，那么，在可生产糖蛋白的真核生物细胞中以gp 250/350(Epstein—Barr病毒的阅读框BLLF—1)为基础开发疫苗是很有前景的。本专利技术涉及哺乳动物细胞系，特别是稳定表达作为Epstein—Barr病毒抗原的糖蛋白(gp 250(220))，糖蛋白(gp 350)和/或杂交糖蛋白(gp 250(220)/(gp 350)的仓鼠细胞系(尤其是在无蛋白培养基中)，由此可避免通过补充培养基而受病毒或细菌污染的危险。本专利技术还涉及生产上述糖蛋白的方法。稳定表达作为EBV抗原的gp 250(220)，gp 350和/或gp250(220)/gp 350的仓鼠细胞系是公知的；参见，例如，Motz等，在Gene，44(1986)，353—359和Vaccines，87(1987)，374—379，以及Gu Shyan等，在100 Jahre Blutserum—Therapie 1890—1990，Halle(Saale)，(1991)，93—100。然而，尚不知道可用来稳定地表达上述糖蛋白的仓鼠细胞系。根据Motz等，在Vaccines 87(1987)，374—379，376中的报道，病毒外源糖蛋白在CHO细胞膜中的整合超过某一点时，会是毒性的。根据本专利技术的一个实施方案，通过下面的遗传学方法提出一种仓鼠细胞系，该细胞系稳定地表达和分泌上述糖蛋白，通过下述方法得到—用表达上述糖蛋白而不是膜锚蛋白(Membrananker)的载体转感细胞系(Motz等，1987)，—其中，载体含有一种细胞系所没有的选择标记，—培养细胞系，利用选择标记选择出一旦选择因子(抑制剂)被消除就能稳定地表达和分泌糖蛋白的细胞。另外的实施例提出在无蛋白培养基中生产稳定地表达上述糖蛋白的仓鼠细胞系的方法的应用，它是通过下述步骤得到的(A)从没有选择标记的仓鼠细胞系(宿主细胞系)开始，该选择标记后来被按照(A)(d)染色体整合的载体表达，或被按照(B)染色体整合的载体表达(重组细胞系)，(a)在含血清培养基中培养细胞，并使它们附着在底物上或相互附着，(b)重复更换部分被消耗的培养基，同时逐步降低培养基的血清含量，最后对其进行无血清培养在此—不主动地消除细胞的附着，—可选地，使细胞球形体形成和分开，分离分开的细胞球形体，在悬浮液中培养同时摇动，选择出在小团粒中生长的或单个生长的细胞(c)最后，使选择出的细胞经过权利要求1的步骤，或者(B)使如权利要求1所述的仓鼠细胞系经步骤(A)(a)至(A)(b)。由于初始细胞系既不能在无血清培养基中转染也不能在无血清培养基中培养，所以使初始细胞系或宿主细胞系在含血清培养基中，例如在MEMα-或α-＋5％FCS中生长。这种培养基的例子是DIF1000，RPMI 1640，ASF 103和HDB。为实现在无蛋白培养基中的生长，存在三个相互关联的问题。1.例如，在使用培养瓶时，利用培养基血清消耗过程中的附着。这种方法的结果是正生长刺激。另外，消耗的旧培养基和死细胞以及溶胞作用的产物能被简便而温和地分离(不用离心)。2.为确保血清消耗过程中培养基良好的自我调节能力，只重复更换部分培养基。3.使细胞进行缓慢搅拌下的长期培养，例如在有球形体形成的悬浮培养物的旋转瓶中。对降低的附着趋势的特定选择使在小团粒中生长的或单个生长的细胞得以分离。首先，分离出大的球形体。然后，在低g值下使上清液分级离心，分离出的小球形体和单个细胞用于进一步转接。当采用权利要求2中所述方法时，在下面的无蛋白培养基中的生长是可能的。下文中，培养基用来指代SMIF(Scharfenberg′s改良Iscove′s培养基，F12培养基)。它是一种特别加富培养基，由约11 Iscove′s改良Dulbecco′s培养基和Ham′s F12营养物(IF)的混合物组成，可以向其中加入例如腐胺(如1.2微摩尔升-1)和L—羟脯氨酸(如153微摩尔升-1)(SMIF1)。另外，对悬浮液中的生长，为螯合二价离子、改善代替无血清培养基(SMIF2)中常采用的蛋白成分运铁蛋白的无机铁的有效性，应优选加入螯合剂，例如，金红三羧酸(ATA，如3微摩尔升-1)(Bertheussen，1993)，EDTA(如4.3微摩尔升-1)和柠檬酸(如40微摩尔升-1)。根据本专利技术的特定实施方案，从中国仓鼠细胞系(CHO)，如CHO K1＝ATCC CCL61，或从小仓鼠肾脏细胞系(BHK)，如BHK21C13＝ATCC CCL10开始，可以得到仓鼠细胞系。如果根据本专利技术，能产生世代时间为例如15至40小时，特别是20至30小时、稳定地表达上述糖蛋白的仓鼠细胞系，这种成就必被视为有创造性的，因为，至今没有人不使用选择性遗传操作而成功地在无蛋白培养基中培养仓鼠细胞系。至今，一般认为，要表达所需基因产物，必须借助遗传工程使哺乳动物细胞系在无蛋白培养基中生长(NSO Cell line，Hassel等，1992)。至于选择标记和抑制剂的选择，熟练人员可根据已有的相关技术。合适的选择标记的一个例子是二氢叶酸还原酶基团(DHFR基因)，合适的抑制剂的一个例子是氨甲蝶呤(MTX)(Motz等，1987)。本专利技术的一个特定实施方案是仓鼠细胞系CHO pPMDIIIGP-TR－PFC6＝DSM ACC 2121。根据本专利技术，经下述步骤得到gp 250(220)，gp 350和/或gp250(220)/gp 350，(a)培养本专利技术的细胞系，使表达所需糖蛋白，(b)从培养基中分离细胞，特别是借助微量过滤，(c)再借助超滤，特别是交叉流超滤，浓缩和纯化清澈的粗上清液，(d)再用阴离子交换柱纯化，(e)超滤以及(f)凝胶过滤，得到最后的纯糖蛋白(gp)级分。根据本专利技术的方法，可以得到天然形式和糖基化形式的糖蛋白。它们因此具有天然的抗原性潜力。由此方法得到的疫苗因而显示与活性EB病毒的各种蛋白质相一致的抗原性特征。得到的疫苗是一种具有高抗原性保护潜力而没有致病潜力的安全疫苗。因为没有产生病毒逆转的可能，也没有灭活病毒的最小危险和毒性，所以就安全性而言，重组疫苗优于灭活疫苗或减活疫苗。实施例1CHO pMDIIIGPTR—PFC6的获本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：H·沃尔夫，K·查尔芬伯格，R·瓦格纳，
申请(专利权)人：H·沃尔夫，
类型：发明
国别省市：