具有引起细胞程序性死亡的特征的单克隆抗体制造技术

一种单克隆抗体，它具有通过与髓系细胞结合，引起髓系细胞程序性死亡（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）的性质。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的具有引起髓系细胞程序性死亡(Apoptosis)的特征，并可做为药物用于治疗髓细胞性白血病的单克隆抗体及其片段，以及与之相关的，产生此单克隆抗体的杂交瘤。由于本专利技术提供的单克隆抗体可作为抗体特异性地识别引起髓系细胞程序性死亡的抗原，并具有引起髓系细胞程序性死亡的特性，因此，可利用这一特性将其做为药物用于髓细胞性白血病的治疗领域。以前，粒细胞集落刺激因子，例如，基因重组粒细胞集落刺激因子(rG—CSF)被认为是主要作为体液因子，刺激粒细胞分化和增生。已有报导在小鼠体内实验中给予rG—CSF，可增强骨髓的造血功能，并可通过脾脏内造血干细胞及各种成血前细胞的增生，显著地引起脾内的髓外造血。这种脾内髓外造血的机制被认为是由于rG—CSF的刺激，改变了脾内的造血微环境，从而增强了造血潜能而引起的血生成过程。由此，本专利技术人注意到通过向脾基质细胞给予rG—CSF的阐明脾内造血潜能和向小鼠脾给予rG—CSF建立造血基质细胞系(CF—1细胞)以分析基质细胞在rG—CSF作用下造血潜能增强程度，以及观察这种潜能在造血基质细胞造血中的作用效果，实验结果是认识到体外的集落刺激活动和体内造血干细胞的支持性潜能。〔Blood，80，1914(1992)〕。但是，虽然已由一些脾基质细胞建立起细胞系(CF—1细胞)，并已由此对其细胞学特点进行考察，但迄今为止，尚未制备出识别其细胞表面抗原的特定抗体，对其特性所知甚少。因此，本专利技术人以上述有关脾基质细胞的资料和研究成果为基础，致力于潜心研究一种可识别脾基质细胞的特定抗体，并以脾基质细胞系作为致敏抗原，通过免疫法制备单克隆抗体，从而获得了新的、未报导过的单克隆抗体。对所获得的单克隆抗体的性质进行检测的结果，本专利技术人惊奇的发现该单克隆抗体具有引起髓系细胞程序性死亡的性质，从而完成本专利技术。本专利技术的目的是提供一种新的具有引起髓系细胞程度性死亡的性质，并可作为药物用于髓细胞性白血病的单克隆抗体及其片段，以及产生此单克隆抗体的杂交瘤。本专利技术的单克隆抗体可极其有效的作为抗体来识别引起髓系细胞程序性死亡〔apoptosis，也称细胞自灭，是一种核染色质DNA以核小体为单位被消化，造成细胞死亡的现象〕的抗原或具有引起髓系细胞程序性死亡的功能。一般而言，髓系细胞包括除淋巴细胞以外的细胞，如中性粒细胞、巨核细胞、成髓细胞、髓细胞、肥大细胞、巨噬细胞、单核细胞和成红细胞。本专利技术所提及的髓系细胞的含义与上述相同。迄今为止，尚无具有引起髓系细胞程序性死亡性质的单克隆抗体，因此本专利技术提供的单克隆抗体定义为包括所有具有引起髓系细胞程序性死亡的性质的单克隆抗体。本专利技术的单克隆抗体的基本制备方法如下述。即，如本专利技术的单克隆抗体的制备方法可以是使用从给予过rG—CSF的动物体内提取的脾基质细胞，用常规的免疫法对其进行免疫，利用常规细胞融合的方法对致免疫的细胞进行细胞融合，并利用常规克隆法使融合细胞克隆化。本专利技术的单克隆抗体的制备方法更可取的范例是用CF—1细胞系为抗原〔Blood，Vol.80，1914(1992)〕，本专利技术人利用给予了rG—CSF的动物的脾基质细胞建立了人工培养细胞系，对以哺乳动物如小鼠的骨髓瘤细胞为抗原而致免疫的浆细胞(免疫细胞)进行融合，使得到的融合细胞(杂交瘤)克隆化，从中选取可产生识别上述细胞系的本专利技术抗体的克隆并进行培养，以重新获得目的抗体。然而这种方法仅是一个示例，例如在这种情况下，不仅上述CF—1细胞系，而且从按照CF—1细胞系的方式得到的从人类脾基质细胞中获取的细胞系均可作为适当的致敏抗原，以制备与上述CF—1细胞系相同方式结合人类髓系靶细胞的抗体。制备这种单克隆抗体的方法中，用上述抗原进行免疫的哺乳动物并无特别的限制。更值得考虑的是选择适宜用于细胞融合的骨髓瘤细胞，一般可选用的适宜动物有小鼠、大鼠及仓鼠。免疫按常规的方法施行，例如给哺乳动物腹腔注射脾基质细胞，如上述的CF—1细胞。更具体的说是将一份免疫细胞稀释或悬浮于适量PBS或等张生理盐水，每月分数次给予动物。作为免疫细胞，最好使用在最后一次给予上述细胞系后摘出的脾细胞。当哺乳动物的骨髓瘤细胞作为异源细胞与上述免疫细胞融合，可形成多种已知的细胞系，其中包括P3(P3×63Ag8.653)〔J.Im-munol.，123，1548(1978)〕，P3—U1〔Current Topics in Micro—bi-ology and Immunology，81，1-7(1978)〕，NS-1〔Eur.J.Im-munol.，6，511—519(1976)〕，MPC—11〔Cell，8，405—415(1976)〕，SP2/0—Ag14〔Nature276，269—270(1978)〕，FO〔J.Immunol.Meth.，35，1—21(1980)〕，S194〔J.Exp Med.，148，313—323(1978)〕和R210〔Nature，277，131—133(1979)〕。上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合可按照常规的基本方法施行，如Milstein el al法〔Mechods Enzymol.，73，3—46(1981)〕。更具体的说，上述细胞融合过程可在有融合促进剂存在的普通营养培养基中进行。作为融合促进剂的有聚乙二醇(PEG)和仙台病毒(HVJ)，此外，视需要适当加入佐剂如二甲亚砜可增强融合效果。考虑免疫细胞和骨髓瘤细胞的比例，前者的数量为后者的1—10倍为宜。用于上述细胞融合的培养基，包括适于上述骨髓瘤细胞增生的RPMI—1640培养基和MEM培养基以及其它常用于培养此类细胞的培养基，另外可同时使用血清补液如新生小牛血清(FBS)。细胞融合的操作是将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养基中充分混合，将预热至37℃的PEG溶液加入培养基，PEG的平均分子量为1,000—6,000，通常添加的浓度为约30—60％(W/V)，混合之。然后，依次重复加入适宜培养基的操作，将反应混合物离心并弃去上清液，即形成所需的杂交瘤。使该杂交瘤通过接种于普通的选择培养基进行筛选，如HAT培养基(含有附加成分次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷的培养基)。在HAT培养基中持续培养足够的时间，以使所需杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡，一般为几天至几周。然后，按常规的极限稀释分析法对产生目的抗体的杂交瘤进行筛选和单克隆化。制备如此制得的产生本专利技术的单克隆抗体的杂交瘤，可在普通培养基中传代培养或在液氮中保存较长时间。从杂交瘤中收集本专利技术的单克隆抗体时，可采用以常规法培养杂交瘤并从上清液获得抗体的方法，或采用给适宜的哺乳动物注入杂交瘤使之增生并从动物腹水中获取抗体的方法。前一种获取抗体的方法适于获得高纯度的抗体，有一种方法适于获取大量抗体。另外，通过上述方法获得的抗体，可采用常规提纯法如盐析法、凝胶过滤、亲合色谱法进一步纯化。本专利技术的单克隆抗体可以是具有后文实施例中所述的固有特性，即具有引起髓系细胞程序性死亡特性的任意一种抗体，只要具有这种特性不论其抗原种类如何均包括在本专利技术范围。利用此特性，本专利技术的单克隆抗体可作为药物用于治疗髓细胞性白血病。不必说，利用本专利技术的单克隆抗体建立识别引起髓系细胞程序性死亡的特异本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：福岛直，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：