可识别细胞表面抗原的单克隆抗体制造技术

一种单克隆抗体，可抑制造血干细胞生长固着并可识别具有支持造血干细胞生长固着支持潜能的脾脏基质细胞的表面抗原。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及可抑制造血干细胞的生长固着的、并可识别具有造血干细胞生长固着支持潜能的脾脏基质细胞的新型单克隆抗体，本专利技术进一步涉及产生该单克隆抗体的杂交瘤。因为本专利技术的单克隆抗体可识别作为抗原的对于骨髓细胞在造血组织中生长固着起重要作用的物质，并且具有抑制造血干细胞生长固着的特性，所以其可用作具有从骨髓内放出白血病细胞、提高对由抗癌药引起的白血病的治疗效果、增强抗癌药的效力的作用的药物，是非常有用的物质。已知粒细胞集落刺激因子，例如基因重组粒细胞集落刺激因子(rG—CSF)基本上作为一种液性因子刺激粒细胞的分化和增殖，并已在小鼠体内实验中报导，给予rG—CSF可增强骨髓造血，另外可在脾脏中引起显著的髓外造血以增殖造血干细胞和脾脏中的所有造血前体细胞。并且认为脾脏中的髓外造血机制是，由于rG—CSF的刺激作用使脾脏造血微环境改变，致使造血能力增强而发生造血过程。因此，本专利技术人注意到在给予rG—CSF后观察脾脏基质细胞，以便了解脾脏中造血能力的增强情况，并从给予了rG—CSF的小鼠的脾脏建立造血基质细胞系(CF—1细胞)，以试图分析基质细胞与rG—CSF对造血能力的增强作用，并使用造血基质细胞检查对造血的支持能力，结果已认识到了其体外集落刺激活性及造血干细胞支持能力(Blood，80，1914(1992))。由于在骨髓移植时同时移植CF—1细胞和骨髓细胞而了解到造血干细胞的体内支持能力，所以认为上述造血基质细胞系(CF—1细胞)具有表达一种细胞粘附因子的功能，该因子可使造血干细胞生长固着在造血组织上。虽然已确定某些具有造血干细胞生长固着支持潜能的脾基质细胞为一种细胞系(CF—1细胞)并已检查了其细胞学特性，但迄今尚未制得识别其表面抗原的特异性抗体，也没有完全了解特性。因此，本专利技术人基于上述有关脾基质细胞的知识和研究结果，努力进行了深入研究以图开发能够识别具有造血干细胞生长固着支持潜能之脾脏基质细胞的特异性抗体，并建立了具有造血干细胞生长固着支持能力的脾脏基质细胞的细胞系，同时使用该脾脏基质细胞系作为免疫抗原制备了单克隆抗体，结果得到了一种新的单克隆抗体。本专利技术人还发现，所得到的单克隆抗体可识别具有造血干细胞生长固着支持潜能的脾脏基质细胞的表面抗原，并具有抑制造血干细胞生长固着的特性，从而完成了本专利技术。本专利技术的目的是提供识别具有造血干细胞生长固着支持能力之脾脏基质细胞的表面抗原，并具有抑制造血干细胞生长固着之特性的新的单克隆抗体，本专利技术的另一个目的是提供生产该单克隆抗体的杂交瘤。本专利技术的单克隆抗体涉及相对于具有造血干细胞生长固着之支持能力的脾脏基质细胞表面抗原的新的单克隆抗体，并且其为识别与增强脾脏造血能力有关的脾基质细胞的抗体，并且它极适用作具有抑制造血干细胞生长固着功能的物质。有时，本文所说的造血干细胞的生长固着是指由造血组织的基质细胞引起的造血干细胞的粘附，以及作为CFU—S集落的细胞分化和增殖。本专利技术的单克隆抗体基本上可按下述方法制得。例如，使用得自投用了rG—CSF的动物的脾脏基质细胞，如由本专利技术人建立的CF—1细胞(脾脏基质细胞)系作为抗原，按照常规免疫方法免疫动物，按照常规细胞融合方法对免疫细胞进行细胞融合，并按照常规克隆方法克隆融合的细胞。作为可举例的制备本专利技术单克隆抗体的方法，其包括使用本专利技术人建立的上述CF—1细胞(作为培养细胞系)作为抗原(Blood，Vol.80，1914(1992))，使以抗原免疫的哺乳动物的浆细胞(免疫细胞)与哺乳动物如小鼠的骨髓瘤细胞融合、克隆所得到的融合细胞(骨髓瘤)、从中选择产生能识别上述细胞系之根据本专利技术的抗体的克隆、并培养之以回收目的抗体。但该方法只是一个例子，并且在这种情况下，例如不只可以使用上述CF—1细胞，而且还可适当地使用按得到CF—1细胞的方法制得的造血组织的其他基质细胞，或衍生于人脾脏基质细胞的造血组织的基质细胞，以按如上述CF—1细胞情况下的同样方式产生目的抗体。制备这种单克隆抗体的方法，对用上述抗原免疫的哺乳动物没有特殊限制；较好选择那些在细胞融合中对将要使用的骨髓瘤细胞有适应性的动物，并且优选使用小鼠、大鼠或仓鼠。按照常规方法进行免疫，例如经腹腔内注射用脾脏基质细胞如上述CF—1细胞免疫哺乳动物。具体地说，最好在适当量的PBS或等渗氯化钠溶液中稀释或悬浮之，每个月给予动物注射几次。较好使用在最后一次给予上述细胞后分离的脾细胞作为免疫细胞。可以使用不同的已知细胞作为与上述免疫细胞相融合的另一亲代细胞，即哺乳动物骨髓瘤细胞，这些已知细胞包括P3(P3×63Ag8.653)(J.Immunol.，123，1548(1978))、P3—U1(CurrentTopics in Micro—biology and Immunology.，81.1—7(1978))、NS—1(Eur.J.Immunol.，6，511—519(1976))、MPC—11(Cell，8，405—415(1976))、Sp2/o—Ag14(Nature，276，269—270(1978))、FO(J.I mmunol.Meth.，35，1—21(1980))、S194(J.Exp，Med.，148，313—323，(1978))和R210(Nature，277，131—133(1979))等。可基本上按照常规方法，例如Milstein等人(MethodsEnzymol.，73，3—46(1981))的方法完成上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。更具体地说，可以在融合加速剂存在下，在常规营养培养基中完成上述细胞融合。可用聚乙二醇(PEG)和仙台病毒(HVJ)作为融合加速剂，并且可在需要时加入适当的佐剂如二甲基亚砜，以增强融合效力。就免疫细胞与骨髓瘤细胞的比例来说，前者优选是后者使用量的1—10倍。用于上述细胞融合的培养基的例子包括适于上述骨髓瘤细胞增殖的RPMI—1640培养基和MEM培养基，以及常规用于培养这种类型细胞的其他培养基；此外，可以在培养基中添加血清如胎牛血清(FBS)。可在上述培养基中将预定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞混合，向培养基中加入预加热到大约37℃的PEG溶液，例如平均分子量为1,000—6,000的，浓度约30—60％(W/V)的PEG的溶液，并混合之以进行细胞融合。然后，经反复重复加入适当培养基，离心反应混合物及上清等操作，以得到所形成的目的杂交瘤。经在常规选择培养基，例如HAT培养基(添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基)中培养来选择所说的杂交瘤。在HAT培养基中持续培养足够时间，以使目的杂交瘤以外的其他细胞(非融合细胞)死亡，一般培养几天到几周。然后，以常规的有限稀释法筛选产生目的抗体的杂交瘤并使之单克隆化。可在常规培养基中继代培养产生本专利技术单克隆抗体的已建立杂交瘤细胞系并在液氮中长期储存。可以使用常规培养杂交瘤并从上清中得到单克隆抗体的方法从杂交瘤中收集本专利技术的单克隆抗体，或者可以将杂交瘤注入适当的哺乳动物体内以使之增殖，然后从动物腹水中得到单克隆抗体。前者适于制得高纯度的抗体，后者适于大量产生抗体。另外，可以使用常规纯化手段如盐析枝术、凝胶过滤及亲和层析法，将按上述方法制得的单克隆抗体纯化到高纯度。因为本专利技术的单克隆抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：福岛直，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：