改进的核黄素生产方法技术

一种重组细菌，它包括被三种栽体或ＤＮＡ序列进行了转化的细菌。同时公开了利用该重组细菌生产核黄素的方法。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
用重组细菌生产核黄素在本
内是已知的，例如参见欧洲专利申请公开No.(EP)405,370。然而目前需要一种。因而本专利技术的一个目的是提供一种重组细菌，它包括用三或四种载体进行了转化的细菌，其中的两种载体每种都含有编码枯草芽孢杆菌的核黄素合成酶活性的DNA序列或基本上同源的DNA序列以及一种或多种转录因子，而第三种和/或第四种载体含有编码枯草芽孢杆菌的ribA基因产物的DNA序列或基本上同源的DNA序列以及选择性地进一步含有转录因子，借此每一种上述载体以一个或多个拷贝的形式整合在该细菌的染色体上的三或四个不同的位点上。更优选地，本专利技术的一个目的是提供一种如上所述的重组细菌，其中含有编码枯草芽孢杆菌的核黄素合成酶活性的DNA序列或基本上同源的DNA序列的两种载体中的每一种都进一步含有两种转录因子，优选是启动子，而第三种和/或第四种载体含有编码枯草芽孢杆菌的ribA基因产物的DNA序列或基本上同源的DNA序列以及一种转录因子，优选是启动子。另外，本专利技术的一个目的是提供一种如上所述的重组细菌，其中含有编码枯草芽孢杆菌的核黄素合成酶活性的DNA序列或基本上同源的DNA序列的两种载体以多个拷贝在染色体的两个不同位点上被整合，第三种和/或第四种载体作为单个拷贝在第三个和/或第四个位点上被整合。另外，本专利技术的一个目的是提供一种重组细菌，其特征在于，附加的编码枯草芽孢杆菌的ribA基因产物的DNA序列或基本上同源的DNA序列不在染色体中的第三和/或第四个位点上被整合，而是被整合在与具有编码核黄素合成酶活性的DNA序列的两种载体中的一种相同的位点上，并且在这个位点上与这种载体一同被扩增。这种构建物可由本领域的技术人员基于其一般知识制造出来，详细的方法，举例来说，在EP405370中给出。另外，本领域的技术人员知道，为了进行转化，所使用的DNA序列没有必要必须以载体的形式存在，它也可以在没有附加载体DNA时被使用。另外，本专利技术的一个目的是提供一种如上所述的重组细菌，它是大肠杆菌(E.coli)或芽孢杆菌(Bacillus)，优选是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蓝细菌(Cyanbacter)或棒杆菌(Corynebacteria)。另外，本专利技术的一个目的是提供一种用于核黄素的生产的方法，其特征在于，如上所述的重组细菌在合适的生长条件下生长，分泌到培养基中的核黄素用本领域已知的方法分离。本专利技术还有一个目的是提供一种用于制备食品或饲料组合物的方法，其特征在于，实施上述生产方法而且由此所得到的核黄素被用本领域已知的方法转化为食品或饲料组合物。词组“基本上同源的DNA序列”，在本专利技术的上下文中表示一种DNA序列，它编码一种氨基酸序列，与其所参照的DNA序列编码的氨基酸序列相比，该氨基酸序列含有超过60％，优选是超过70％，更优选是超过80％以及最优选是超过90％的相同的氨基酸，并且这种DNA序列编码来自于相同或不同生物体的相同的酶，它或者是部分或全部合成来源的。可用于本专利技术目的的DNA序列包括编码蛋白质的DNA序列，该蛋白质具有与用前述DNA序列编码的蛋白质相同类型的酶活性，该DNA序列从下面选出(a)一种DNA序列，它在标准条件下与上面定义的序列杂交；(b)一种DNA序列，由于遗传密码的简并性，它不与序列(a)杂交，但它编码与用这些DNA序列编码的多肽具有完全相同的氨基酸序列的多肽；(c)一种DNA序列，它是(a)或(b)中规定的DNA序列的一个片断。用于杂交的“标准条件”在本文的上下文中是指本领域的技术人员通常使用的检测特定杂交信号的条件，举例来说，Sambrook等人在“Molecular Cloning”second edition，Cold Spring Habor LaboratoryPress l989，New York中对这些条件进行了描述；该“标准条件”或者优选地是指本领域的技术人员所熟悉的所谓严格杂交和非严格清洗条件，或者更优选地是指所谓严格杂交和严格清洗条件，例如Sambrook等人(无日期)对其进行的描述。“DNA序列的片段”在本文的上下文中是指这样一种片段，它编码一种仍然具有上面所规定的酶活性的多肽。可用于本专利技术目的的DNA序列被公开于例如EP405,370的说明书中。这类序列的序列信息也可以从任何已知的序列数据库中获得，例如the European Bioinformatics Institute(Hinxton Hall，Cam-bridge，GB)。然后就可以使用例如本
已知的PCR方法在这些序列信息的基础上制备DNA序列，这被描述于例如实施例中，或采用本领域已知的其它分子克隆方法，描述于例如EP405,370中。一旦可以得到这些DNA序列，为进行进一步操作可以将它们整合到本
已知的合适的载体中，这描述于例如EP405,370的实施例中。优选那些用于整合到宿主染色体中的载体，优选载体是芽孢杆菌，更优选是枯草芽孢杆菌，如果需要的话，随后进行扩增。这些载体被描述于例如实施例中或在本
内是已知的，例如参见EP405,370。这些载体可以进一步携带所谓的转录因子，如增强子和/或启动子，如veg-增强子和/或天然或合成核糖体结合位点和/或终止子，例如本
已知的cryT-终止子，例如参见EP405,370。然后就可以用例如描述于实施例中或本
已知的方法用这些载体将所需的宿主细胞转化，参见例如EP405,370，并使这些细胞在合适的培养基中生长并且分泌到该培养基中的核黄素可以用描述于实施例中或本
已知的方法进行分离。至此已对本专利技术进行了大体的描述，下面的图和实施例是为了对本专利技术进行详细说明，它不在任何程度上限制本专利技术。附图说明图1表达载体pDSNdeHis。A由亲本载体pDS/RBSII，6xHis(-2)构建pDSNdeHis。所存在的NdeI位点通过切开、粘性末端的填补和重新连接而被除去。所得到的质粒用BamHI和HindIII切开，含有限制位点ClaI、NdeI、SalI、BamHI和HindIII的合成的多接头被引入。B显示的是从Shine-Delgarno序列(S/D盒)到多克隆位点的pDSNdeHis序列以及用于纯化重组蛋白的具有连续组氨酸残基的肽。图2质粒pXI12和pXI16。质粒pXI12用一个环表示。用于一些限制酶的识别部位用标准的缩略语列出。载体的重要元件被标记如下PvegI中度强度，来自枯草芽孢杆菌的组成型启动子；RBS合成的核糖体结合位点；cryT来自苏云金杆菌(B.thuringiensis)的转录终止子；ermAM组成性地表达的抗红霉素基因；sacB-3′和sacB-5′通过同源重组用于整合的同源区域，得自枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶(levansu crase)基因；amp来自pBR322的抗氨苄青霉素基因；ori来自pBR322的复制起点；rop来自pBR322的rop基因。一些元件的方向用箭头表示。在该质粒的上部显示了具有-35和-10区域的启动子。箭头指向的是T至C的突变，引入该突变是为了在pXI16中产生ApaI位点(中间那条线中的盒子)。最上面那条线显示的是pXI16的启动子中断序列和引入的限制位本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组细菌，它包括用三种载体或ＤＮＡ序列进行了转化的细菌，其中的两种载体或ＤＮＡ序列每种都含有编码枯草芽孢杆菌的核黄素合成酶活性的ＤＮＡ序列或基本上同源的ＤＮＡ序列以及一种或多种转录因子，第三路载体或ＤＮＡ序列含有编码枯草芽孢杆菌的ｒｉｂＡ基因产物的ＤＮＡ序列或基本上同源的ＤＮＡ序列以及选择性地进一步含有转录因子，借此每一种上述载体以一个或多个拷贝的形式整合在该细菌的染色体上三个不同的位点上。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：HP霍曼，M赫姆伯林，A宛龙，W舒尔特，
申请(专利权)人：DSMIP资产有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]