将秋水仙素类化合物生物转化成相应的3-糖基衍生物的方法技术

用巨大芽孢杆菌菌株将秋水仙素类化合物转化成相应的３－Ｏ－糖基衍生物。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用选定的微生物菌株将秋水仙素类化合物生物转化成相应的3-O-糖基衍生物的方法。本专利技术的方法可以从秋水仙素、硫代秋水仙素或其衍生物以高产率和高纯度制得在仅在芳环A的C-3上糖基化的秋水仙素类化合物。在苯环的C-3位糖基化的秋水仙素类化合物由于其非常有效或可用于制备新的药物而具有非常显著的药理学重要性。具体地讲，硫代秋水仙碱苷(3-O-葡糖基硫代秋水仙素)是药物领域中的一种非常重要的活性成分，主要用于治疗肌肉-骨骼系统的疾病，并用作制备新的抗肿瘤、免疫抑制、抗牛皮癣和抗炎药物的原料。以前通过化学反应或生物转化的方法对制备3-糖基秋水仙素类化合物进行了大量尝试。化学路线由一系列复杂、非特异性的反应组成，反应结果生成糖基化衍生物的混合物，其中的一些衍生物是无活性的。因此，转化生成在芳环的C-3位特异性糖基化的有效产物的收率非常低。生物学途径实际上涉及通过培养积雪草(Centella Asiatica)将硫代秋水仙素生物转化成在芳环的C-2和C-3单糖基化的衍生物；因此，这种生物转化的选择性不高，并且收率和产量均很低(Solet,J.M.等，植物化学33,4,817-820,1993)。将秋水仙素类化合物进行生物转化的其它尝试可以仅使连接在芳环(C-2和C-3位)上的甲氧基脱甲基化，但是，这些方法的产率和产量通常很低，并且区域选择性很差。因此，Hufford C.D.等(药物科学杂志，68,10,1239-1242,1979)使用灰色链霉菌和/或壮观链霉菌，Bellet.P.等(GB-923421,1959)使用链霉菌的不同菌株和其它种的细菌和真菌，试图将秋水仙素及其衍生物转化成相应的3-脱甲基化的衍生物。这些已知方法的结果证实了以上关于微生物酶所涉及的例如在生物碱分子的C-2、C-3或C-10位的非立体选择性的描述。此外，所述催化系统的产量水平非常低，这是由于转化收率低，可使用的底物浓度下降以及环庚三烯酚酮的经常降解。最近，Poulev等(J.Ferment.Bioeng.79,1,33-38,1995)实现了细菌微生物的特异性生物转化，但收率和产量仍然很低。来自与上述微生物(链霉菌、芽孢杆菌)相似的微生物的酶活性已应用于生物转化其它化合物，例如美登苷(maytansinoids)(美国专利，4361650；Izawa,M.等，抗生素杂志,34,12,1587-1590,1981)。在这种情况下，催化反应也是完全由脱甲基化反应组成，并且转化率和产量很低。来自巨大芽孢杆菌的α-淀粉酶的糖基转移酶活性已有记载(Brum,P.J.等，淀粉43,8,319-323,1991)；该转移酶反应(仅限于葡萄糖或葡糖苷)的受体特异性非常高。由同种微生物产生的环糊精-葡糖基转移酶可催化rubusoside(13-O-β-D-葡糖基-斯替维醇β-D-葡糖基酯)的α-1,4-转葡糖基作用。另外，在该生物转化中，转移酶反应的受体是底物糖部分(Darise,M.等，Agric.Biol.Chem.,48,10,2483-2488,1984)。以前将环糊精-糖基转移酶用于从淀粉中制备环糊精G6、G7和G8(Kitahata,S.,Okada,S.,农业生物化学38,12,2413-2417,1974)。这些实例证明了由巨大芽孢杆菌表达之糖基转移酶活性的高度底物特异性，其只与糖受体有关，因此不涉及任何有不同复杂分子结构之二级代谢产物如秋水仙素类的反应。事实上，没有已知将所述微生物用于将秋水仙素类酶促转化成3-糖基衍生物的实例。现在已经发现，存在高浓度秋水仙素和硫代秋水仙素的条件下能够生长的巨大芽孢杆菌菌株具有非常高的生物转化活性，可将秋水仙素类底物转变成仅在芳环C-3上糖基化的秋水仙素。所述转化在很短的时间内发生，而且产率之高令人惊奇。因此，本专利技术涉及制备式(Ⅰ)3-O-糖基秋水仙素化合物的方法 其中R1是O-糖苷基，R2是氢或C1-C7酰基，R3是C1-C6烷氧基或C1-C6硫代烷基，该方法包括用巨大芽孢杆菌生物转化其中R1是OH或甲氧基的化合物。巨大芽孢杆菌是革兰氏阳性孢子产生的细菌，细胞直径大于1.0μm；在许多培养基中需氧生长；过氧化氢酶阳性；水解明胶。正如通过生长检测和显微镜分析所证实的，用于本专利技术的巨大芽孢杆菌菌株能够令人满意地生长并在高浓度秋水仙素和/或硫代秋水仙素(高于3g/l)时也能存活。已经证明同属种如蜡状芽孢杆菌在底物浓度为1.5g/l时很难生长(对照吸收值的15-25％)，在浓度为3g/l时更显著，有显著的自溶作用。相反，在上述浓度时，与蜡状芽孢杆菌相比，所选的巨大芽孢杆菌培养物可达到达很高的生长水平(2倍或3倍)。生物转化的高选择性和效率是令人惊奇的并且是超乎寻常的，产率水平为80-100％，通常约90-95％。此外，所述生物转化中所用的微生物能够持久地保持催化活性，甚至在重复培养步骤中也是如此，因此，可在补料分批培养和连续培养过程中提供特异性的生物转化。因此，该方法的生产力和重现水平均很高。除显著的生产率外，显著的反应区域选择性确保了所得产物的高质量和纯度，因此，可以100％的纯度提供产物，只需简单的续加工。另外的重要优点是减少了产物的纯化和回收步骤，该方法更经济和简单，使用更安全。筛选可用于本专利技术方法的细菌菌株的操作过程包括A)从天然来源或收集的菌株开始，选择在高浓度秋水仙素底物存在下能够生长的巨大芽孢杆菌。B)利用特异性底物(以逐渐增加的浓度施用)上的生物转化试验，筛选来自A)的分离株以证实将秋水仙素转化成相应的3-O-糖基衍生物的转化活性。C)B)中所选菌株的微生物学特征。D)利用B)细菌种群的靶特异性筛选，逐渐提高生物转化产率。E)研究并优化标准发酵参数以便使生物转化达到最佳。F)研究并优化用于高生产力培养物的转化方法以确保得到工业规模生产所用的稳定的均匀的接种物。G)以发酵罐、分批、补料分批和连续加工逐渐扩大该方法的规模。H)用于产物后续加工和回收的后处理和优化方法。具体地说，通过在含有机氮(胨、酵母提取物、肉提取物、天冬酰胺等)、碳源(甘油、淀粉、麦芽糖、葡萄糖等)的不同琼脂培养基上，在pH为5-8，优选6-7下，从菌株保藏中心或各种来源的土壤样品得到的收集培养物筛选可用于本专利技术的微生物。培养温度为20-45℃，优选28-40℃。在其中已预先加入了浓度为0.1-3g/l秋水仙素或硫代秋水仙素(以便抑制大部分微生物的生长)的不同琼脂化底物上，通过梯度稀释和平行铺板技术评估在存在毒性浓度的待转化秋水仙素底物的条件下，培养物生长的能力。无菌取出能够在所述条件下生长的菌落，并放在不同琼脂化培养基上以确定其纯化和生长的均一性。用于转化培养物的培养基是典型微生物底物，其含有有机氮(胨、酵母提取物、胰胨、肉提取物等)、碳源(甘油、麦芽糖、葡萄糖等)的不同琼脂培养基上，在pH为5-8，优选6-7下，可以从菌株保藏中心或各种来源的土壤样品中得到的收集培养物筛选可用于本专利技术的微生物。培养温度为20-45℃，优选28-40℃。然后在存在秋水仙素类化合物的条件下，检测所选微生物在浸没培养中生长的能力和将秋水仙素类化合物转化成相应的3-糖基衍生物的能力。所述检测在含20ml液体培养基的100本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备式（Ⅰ）３－Ｏ－糖基秋水仙素类化合物的方法： ＊＊＊ （Ⅰ） 其中Ｒ↓［１］是Ｏ－糖苷基，Ｒ↓［２］是氢或Ｃ↓［１］－Ｃ↓［７］酰基，Ｒ↓［３］是Ｃ↓［１］－Ｃ↓［６］烷氧基或Ｃ↓［１］－Ｃ↓［６］硫代烷基，该方法包括用巨大芽孢杆菌生物转化其中Ｒ↓［１］是ＯＨ或甲氧基的化合物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：E鲍姆巴德利，C庞佐恩，
申请(专利权)人：因迪纳有限公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]