用于工业发酵生产赤霉素A*及A*的藤仓赤霉菌突变株制造技术

本发明专利技术涉及一株新的藤仓赤霉菌菌株，命名为ｙ－０８，其菌丝呈白色，略产紫色色素，能产生卵圆形至长圆形小分生孢子，所述的菌株在藤仓赤霉菌的正常发酵条件下发酵产生赤霉素Ａ↓［４］、Ａ↓［７］及Ａ↓［３］产物的比例约为７０－８０∶１０－１３∶７－２０（重量比）。本发明专利技术的菌株能用于大规模发酵生产赤霉素Ａ↓［４］及Ａ↓［７］，而不希望的赤霉素Ａ↓［３］产量很少，使得工业生产赤霉素Ａ↓［４］及Ａ↓［７］非常简便。本发明专利技术还涉及利用ｙ－０８菌株生产赤霉素Ａ↓［４］及Ａ↓［７］的方法。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株新的用于工业发酵生产赤霉素A4及A7的菌株，更具体地，本专利技术涉及一株新的能发酵产生高水平赤霉素A4及A7的藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)菌株，此菌株被命名为y-08菌株。众所周知，赤霉素类物质是植物生长调节剂，它有很多同系物，目前在自然界中已发现84种，根据发现的早晚，这些同系物被命名为赤霉素A1(GA1)、GA2、GA3、GA4……GA84。其中GA3、GA4和GA7的结构式如下所示 不同的赤霉素同系物对植物的生长调节作用是不同的，如GA3主要是促进植物枝叶的生长；GA4、GA7都具有促进植物果实细胞的伸长作用，但对花芽分化和植物其它功能又有所不同。目前已实现大量生产的是GA3，而GA4+7(GA4和GA7的混合物)仅在美国有少量生产，年总产量不超过1吨。GA4+7在美国主要用于苹果使果形变高，萼部五棱突出，称之为“高庄苹果”或“蛇果”。近几年来，本专利技术人在国内的少量试验表明GA4+7除了对苹果有明显的改变果形效果外，对梨能增产20-50％，并能使之提早成熟半个月，对油菜增产20％，个别增产70％，对水稻、小麦等能增产10-20％，这些结果显示出GA4+7对农作物的巨大增产潜力，是前景宽广的新产品。目前已知产生这些赤霉素的有植物和微生物，由于微生物生长速度快，可以通过一些生物技术手段较快地提高代谢产物的产量，因此迄今为止商品赤霉素都由微生物生产。不同的微生物种和菌株产生的赤霉素种类和比例是不同的，因此工业生产某种赤霉素时，需要对微生物进行选育，不仅要使目的赤霉素产量高，其它赤霉素产量低，而且要求工业生产简便。迄今为止，仅有少量生产的GA4+7是采用GA3型的菌种，所谓GA3型菌种，是指在正常的环境条件下该菌种以产生GA3为主，只有强制改变环境的pH条件(如pH6-7)，有时伴随温度的升高(如从28℃升至32-34℃)才能使分泌到发酵液中的GA4、GA7增加，而抑制GA3的积累。由于这种工艺使生产菌处于非正常状态，虽然能增加GA4、GA7的比例，但GA4+7的产量仍很低，并且GA3至少还占1/3(例见真菌学报14(4):302-309,1995)。因此，不少研究者为获得GA4、GA7的专用菌种作了许多工作，其中Wilhelm Rademacher等(Bioche.and Biophy.Res.Comm.91(1),1979)发现木薯疮痂病的病原菌Sphaceloma monihoticola只产生GA4，但是GA4的产量太低，仅为400μg/L发酵液，比通常的出发菌株几乎低500倍，要求达到工业生产的最低水平难度很大，至今未见进一步报道。另外一项研究报告(B.Bruchner等，Applied Microbiol.Biotechnol.75(3),1991)公开了一株藤仓赤霉菌的突变株14/141,该突变株GA3微生物合成的最后一步被阻断，因而代谢产物中积累GA7(微生物合成赤霉素的其中一条途径是→→→GA4→GA7→GA3)。这一突变株的GA7产量未见报道，即使其GA7产量高，但是由于其不能积累GA4，而目前已知GA4的作用大于GA7，且需要量大，因此仍需要开发能发酵产生高水平GA4和GA7的菌株。因此，本专利技术的目的在于提供一株新的能发酵产生高水平赤霉素A4及A7的菌株，本专利技术的菌株被命名为藤仓赤霉菌菌株y-08，其能用于大规模工业化生产GA4+7。本专利技术的另一目的在于提供一种大规模发酵培养产生高水平赤霉素A4及A7的方法，所述的方法使用本专利技术的y-08菌株，简便易行。具体地说，本专利技术涉及一株新的藤仓赤霉菌菌株y-08，其发酵产生高水平的赤霉素A4和A7，同时赤霉素A3水平较低。本专利技术的藤仓赤霉菌菌株y-08已于1997年10月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0325。y-08菌株是从数百株野生藤仓赤霉菌中筛选，并经多种化学物理诱变处理培育而成。该菌株菌丝呈白色，略产紫色色素，能产生卵圆形至长圆形小分生孢子。该菌株经每月传代一次，目前共传代12代，从菌丝生长速度、产色素情况、产孢情况、特别是产GA4和GA7情况看，表现都十分稳定。另外，经测定，y-08菌株的致病性已完全丧失。藤仓赤霉菌也称水稻恶苗病菌，得到这种微生物的最好途径是从水稻恶苗病植株中分离，因此，本专利技术人采用的原始出发菌株是采自浙江农村水稻田的恶苗病植株中的编号为46的菌株。该46菌株产生深紫色素，有大分生孢子和小分生孢子，其经多次紫外诱变和亚硝基胍诱变筛选，终于获得一株GA7渗漏型变异株，命名为y-08。经测定y-08菌株有很强的发酵产生赤霉素A4+7的能力，而GA3的产量很低。本专利技术还涉及一种大规模发酵生产赤霉素A4和A7的方法，包括如下步骤(1)将本专利技术的y-08菌株接种在摇瓶中的液体种子培养基中，28℃振荡培养约48小时得到一级种子培养物；(2)将一级种子培养物以0.1-2％的比例(体积比)接种入种子罐中的液体种子培养基中，28℃通气搅拌培养约30小时，得到二级种子培养物；(3)将二级种子培养物以5-10％的比例(体积比)接种入发酵罐中的发酵培养基中，于28℃通气搅拌培养150-168小时，收集发酵液；(4)过滤发酵液，用大孔吸附树脂柱吸附，用丙酮洗脱吸附树脂柱，浓缩得到含赤霉素类物质的浓缩液；(5)将浓缩液pH调整为约pH6，加乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取液得到GA4结晶和母液；(6)将步骤(5)提取GA4后的萃余液的pH调节至约pH4.4-4.5，加乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取液得到GA7结晶和母液。另外，在本专利技术所述的方法中步骤(3)还可变化为将接种后的发酵培养基于28℃培养48小时后，加入CaCO3悬浮液以调整发酵液pH至约pH6，并将罐温升至34℃，继续培养约120小时，收集发酵液。本专利技术中y-08菌株发酵所用的种子培养基和发酵培养基可以是任何常规用于藤仓赤霉菌发酵的培养基，例如种子培养基可为1％淀粉、1.5％豆饼粉、1％葡萄糖、0.05％(NH4)2SO4、0.12％KH2PO4、0.1％MgSO4,pH自然。发酵培养基可为7％淀粉、0.9％豆饼粉、0.3％花生饼粉、0.05％(NH4)2SO4、0.08％KH2PO4、0.05％MgSO4、0.001％硼酸，pH5.8。在获得y-08菌株之前，GA4+7的发酵是应用GA3型生产菌进行，为了抑制GA3的积累，必须采取二个措施一是调节pH，即将发酵培养基的pH从发酵48小时时的pH3.5-4.0人为地升至pH6.7左右，这样就会减少GA3产量，增加GA4+7产量。二是升高温度，即发酵48小时后，温度由28℃升至32-34℃，这也对积累GA4+7有利。但是由于调整pH和升高温度对藤仓赤霉菌都不是正常的生长环境，所以导致藤仓赤霉菌非常容易自溶，GA4+7总产量也不高。而y-08菌株可以在正常生长环境条件下积累GA4+7，其发酵产生赤霉素A4、A7及A3产物的比例约为70-80∶10-13∶7-20(重量比)，使得大规模工业发酵生产GA4+7成为可能。而当将y-08菌株在如上所述的pH调整和变温处理条件下发酵时，其GA3的比例有所下降，GA7的比例增加，例如，赤霉素本文档来自技高网...

【技术保护点】
藤仓赤霉菌菌株ｙ－０８，其菌丝呈白色，略产紫色色素，能产生卵圆形至长圆形小分生孢子，该菌株于１９９７年１０月６日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为ＣＧＭＣＣＮＯ．０３２５。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：颜方贵，林锦湖，
申请(专利权)人：中生北方生物工程开发研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]