制备纯化的骨诱导因子二聚体的方法技术

制备纯化的骨诱导因子二聚体的方法，包括将用基因工程制备的骨诱导因子包函体依次经历下面的ａ）－ｅ）步骤：ａ）用解折叠剂处理骨诱导因子包函体从而制备溶解的单体的步骤；ｂ）用重折叠液处理该溶解的单体从而制备二聚体的步骤；ｃ）将该重折叠二聚体进行超滤和溶剂更换的步骤；ｄ）对上述制备的二聚体溶液进行等电点沉淀的步骤；和ｅ）对经过等电点沉淀的二聚体进行反相层析的步骤。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
本专利技术涉及制备纯化的二聚化骨诱导因子的方法。更为具体地，本专利技术涉及制备二聚化骨形态发生因子的方法，其特征在于从通过基因工程而制备的骨形态发生因子包函体中获取纯化的二聚化骨诱导因子。
技术介绍
人们发现骨基质存在一种蛋白性的骨诱导因子(科学150，pp.839-899，1965)，并被命名为骨诱导因子(以下简称BMP)。近年来，已尝试多个与BMP相关的基因并发现都属于转化生长因子-β(以下简称TGF-β)超家族。运用基因工程技术，已制备出这些载体的一些重组体并且证实它们具有骨诱导活性，正是基于这一点人们正期待着能将这些重组体应用到骨科疾病的治疗中。其中，动物实验已证明最近发现的、属于人BMP家族的人GDF-5(MP52)(生化.生物物理.研究通讯.204.pp.646-652.1994)作为骨诱导因子是有效的，而且目前正在技术总结从而通过用基因重组大肠杆菌表达对其进行大量制备。可是，当在大肠杆菌及其它菌株中大量表达时，例如，当以每升培养液数克的量制备蛋白质时，目的蛋白质往往会形成既无活性又不溶解的包函体(颗粒体，inclusionbody)。这种包函体是单体，要想使其成为有活性的骨诱导因子二聚体必须先使其溶解、复性成二聚体的原先结构(通常称做重折叠操作)，进行分离、纯化以得到目的蛋白质。因为MP52的活性形式包含下面或别的问题，因而使其纯化方法非常困难。1)由于其在水溶液中溶解度低，故必须在变性剂作用下或酸性条件下操作2)分离时使用的蛋白质趋向于非特异性地吸附到用于液相层析的树脂上，和3)重折叠时不可少的表面活性剂会防碍后面的分离。为了解决上面叙述的问题，最近专利技术的成功地获得单一活性形式MP52的纯化方法(WO 96/33215)，包括下面的步骤1)用变性剂溶解包函体，2)离子交换层析分离，3)磺化，4)胶滤过层析分离，5)重折叠，6)等电点沉淀回收，7)反相层析分离。可得到单一活性型的MP 52。可是，这种方法面对工业化大规模生产，还存在以下等的一些问题1)为了溶解MP 52包函体，必须使用大量的变性剂，由此会诱发蛋白质修饰(例如，使用尿素时会引起氨甲酰化反应)，2)必须大量使用价格昂贵的层析，特别是凝胶过滤层析用树脂，如Sephacryl S-200 HR、Superdex 200pg(均为Pharmacia Biotech制备)，3)重折叠时使用的试剂，特别是二聚体反应时不可缺的CHAPS和氧化型谷光甘肽非常昂贵，和4)进行等电点沉淀时，为了降低表面活性剂的浓度必须进行稀释操作，从而增加了该溶液的体积。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决上述的问题，即1)尽量减少变性剂的使用量；2)尽量减少层析法用树脂的使用量；3)用其它价格便宜的材料替代重折叠时使用的试剂；4)通过选择性地除去表面活性剂，进而调整液量；及简化与之相匹配的操作，这样一来，时间也大幅度地缩短了。本专利技术者们，对从大肠杆菌中提取出来的包函体用变性剂进行溶解，经稀释操作直接进行重折叠，接着进行超滤代替重折叠液，这样使简化纯化过程成为可能。这种方法尽管和利用大肠杆菌生产人胰岛素方法的最初步骤(EP 600372 A1)相类似，但人工胰岛素是水溶性的蛋白质，而骨诱导因子却不溶于水，两者在性质上有差别，因此照搬胰岛素的制备方法，将其应用到骨诱导因子的生产中去是困难的。进行大量生产时，如前面提到的那样，二聚体化的MP 52(活性型)的溶解度低，而且易于吸附在层析用树脂上，所以无法使用在人工胰岛素生产中使用的离子交换和疏水层析及前面WO 96/33215中提到的使用的凝胶过滤层析。例如当采用离子交换剂(Pharmacia Biotech、SP Sepharose FF)时，MP 52是无法彻底洗脱出来的，因为它强烈地吸附在树脂上，即便使用变性剂和饱和浓度的盐。在使用凝胶过滤(Pharmacia Biotech，Sephacryl S-200 HR)时，由于蛋白强烈地吸附在树脂上，即便使用变性剂使分离范围大大地扩大，分离也是非常难的。此外，由于受表面活性剂如CHAPS的影响，树脂的性质发生变化，导致重折叠能力消失。这也适用于采用能够溶解MP52的酸性溶液的洗脱。总之，充分发挥树脂原本的性质是不可行的。通过以上分析，我们可以清楚看到采用一般的水性系统根据一般的层析方法不能在大量生产时纯化目的蛋白。唯一能够利用的是应用有机溶剂进行逆相层析法，所以必须开发一种不必使用多根柱子的纯化方法。作为除柱子法以外的纯化方法，硫酸铵分离法看上去最令人鼓舞。可是，因为硫酸铵分离法纯化效果差，而且导致不必要的低产出，也常不被采用。此外就是采用pH值调节的等电点沉淀法，如果在实际操作前先进行超滤，从而除去表面活性剂CHAPS，这样就可以进行不增加液体量的等电点沉淀了。以往的方法，由于CHAPS存在，蛋白质的溶解度大，并且无沉淀出现，因此必须通过稀释操作以降低CHAPS的浓度，但这样一来，液体的使用量大幅度增加，这也是纯化工程上的问题。本专利技术涉及纯化骨诱导因子二聚体的制备方法，特征是将根据基因工程技术生产出来的骨诱导因子包函体依次进行下面叙述的a)-e)步骤，因而制备骨诱导因子二聚体。a)用变性剂处理骨诱导因子包函体得到溶解的单体，b)用重折叠液处理上步得到的溶解单体，得到二聚体，c)通过超滤和替换溶剂处理此二聚体骨诱导因子，d)对经过上述处理得到的二聚体在替换的溶液中进行等电点沉淀，和e)对经过等电点沉淀处理的二聚体进行反相层析。由基因工程技术生产出来的骨诱导因子包函体优选是根据基因工程技术由大肠杆菌表达。大肠杆菌表达骨诱导因子时，先用缓冲液悬浮细菌，用匀浆器匀浆且离心以回收包函体。用含去污剂的缓冲液，例如Triton X-100，或尿素，洗涤包函体三次后，进行离心分离，得到初步纯化的包函体。用变性剂处理骨诱导因子包函体使其成为溶解的单聚体步骤，是把包函体加到含有变性剂的溶液中去、搅拌使之溶解。作为含有变性剂的溶液，可以使用众所周知的溶液，例如含8M尿素或6M盐酸胍等的50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH10.7)等。用重折叠液处理溶解的单体使之成为二聚体的步骤，是把上步得到的蛋白质溶液用重折叠液稀释成终浓度为0.1-5.0mg/ml的蛋白质溶液，优选2.4mg/ml。虽然迄今为止，都要求把变性剂的终浓度稀释到1M以下，但在本专利技术中，优选把变性剂的终浓度稀释到1-4M之间，特别是2.4M，从而可以防止蛋白质的凝集和沉淀，提高回收率。作为重折叠溶液，可以使用如众所周知的表面活性剂，如胆酸及其衍生物如3--2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPS)、牛磺胆酸或其盐、牛磺脱氧胆酸或其盐、且优选为3--2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPS)；EDTA；还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)和氧化型谷光甘肽的混合物，或含有半胱氨酸等的缓冲液。仅仅用半胱氨酸的优点在于它不必象平常那样使用价格昂贵的氧化剂或者能减少其用量，因此其有希望节省试剂成本和简化加工步骤。重折叠液中包含的试剂除上面提到的外，还含有具有也有防止蛋白质凝集和沉淀并提高产量的胍基的化合物，更为具体地，事先将盐酸胍盐或盐酸精氨酸盐(Arg.Hcl)优选为0.5M盐酸精氨酸盐加重折叠液中。表1所示为添加盐酸精氨酸盐后本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备纯化的骨诱导因子二聚体的方法，其包括将根据基因工程技术生产的骨诱导因子包函体依次按照下面ａ）－ｅ）的步骤进行实施，从而生产出骨诱导因子二聚体；ａ）用变性剂处理骨诱导因子包函体从而得到可溶性单体，ｂ）将得到的可溶性单体，用重折叠液 进行处理，从而得到二聚体，ｃ）对重折叠的二聚体进行超滤替换溶剂处理，ｄ）对经过上述处理得到的二聚体溶液进行等电点沉淀，和ｅ）对经过等电点沉淀处理的二聚体进行反相层析。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：本田淳，安藤英俊，杉本俊二郎，
申请(专利权)人：赫斯马里恩鲁索株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]