胰岛素原的Ｃ肽构象与天然蛇毒去整合素中ＲＧＤ序列的构象相似，Ｂ链末端Ｂ３０位点与Ａ链Ａ１位点之间空间距离约为７．５埃。因此设计嵌合ＲＧＤ序列为：ＣＲＧＤＳＣ，该序列取自纤维粘接蛋白，一种血源性的与血小板整合素有较强亲和力的多肽，能表现较强抗拴活性功能的ＲＧＤ序列。用于接构建重组抗拴多肽的模板基因为Ｃｙｓ Ａ６ Ｓｅｒ，Ｃｙｓ Ａｌｌ Ｓｅｒ胰岛素原基因。所应用的基因工程方法是ＰＣＲ方法的多步组合。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
生物化学与分子生物学，基因工程
现有技术心脑血管疾病率已成为现代社会严重危害人类自身健康的一类疾病，包括高血压、冠心病、心肌梗塞、脑血栓等等。在治疗这类疾病的过程中，人类一直把追求更高效、专一、更易得的各类抗栓、溶栓药剂作为治疗、预防该类疾病的最佳途径。血栓的非正常性形成往往是导致此类疾病的根本环节，因而如何预防人体循环系统中血栓的非正常性形成也就成为科学界、医学界关注的焦点，从最初采用，至今仍被广泛使用的Aspirin阿斯匹林，到血栓烷合成酶抑制剂，再到血栓烷受体拮抗剂，直至迄今被证明最为高效、专一的天然蛇毒去整合素，这方面的论文如Huang，T.F et al(1987)J.Biol.Chem，262，16157-16163；Huang T.F et al(1989)Biochemistry，28，661-666；Gan Z.R et al(1988)J.Biol.Chem，263，19827-19832]，走过了一条漫长道路。源自天然蛇毒、水蛭毒素的去整合素，是高效的血小板整合素GP IIb IIIa的拮抗剂，能竞争性地与纤维蛋白原结合GP IIb IIIa，从而抑制血小板-纤维蛋白与血小板-血小板之间的相互作用，抑制血小板在血管壁上的粘附与聚集，抑制血栓的形成。源自天然蛇毒、水蛭毒的去整合素多肽种类繁多，但它们都具有共同的结构特点与作用机制(1)皆为短链多肽，分子量小，在10K Da以下；(2)都具有共同的保守序列，即RGD序列(精氨酸Arg-甘氨酸Gly-天冬氨酸Asp序列)，组成多肽的功能区；(3)RGD序列一般都位于短链多肽的突环区顶端，常有β折叠支持，位于分子表面，亲水性较强；(4)多肽分子的内部通常具有两对以上的二硫键。天然去整合素多肽对血小板聚集的抑制活性很高，IC50值一般在10-7M水平。但蛇毒资源有限，并且纯化工艺苛刻，严重限制了天然抗栓肽的实用性，目前主要用于科研中。因此目前国际上主要发达国家如美、日、德等以及一些跨国性大药厂纷纷希望用基因工程方法，基于天然去整合素的研究，设计、创造新型RGD-基因工程抗栓肽，将来用于科研、医疗临床领域。目前临床医疗用的抗栓剂主要还是Aspirin(阿斯匹林)，漯代他汀等化工制药，这类药有一定效果，但用药量大、副作用大。国际上基因工程抗栓剂的研究都处在实验室阶段，抗栓效果都不强。日本蛋白质工程研究所的Takao Yamada小组利用基因工程方法，在人溶菌酶基因的HincII位点插入体外合成的RGD序列编码位点的双链DNA片段形成一个含有RGD编码框的重组人溶菌酶基因，在酵母体系表达，纯化，得到RGD-人溶菌酶多肽，但该肽的抗栓生物活力远远低于天然抗栓肽，要低两百倍到五百倍.美国Smithkline Beecham制药公司的Grace Lee，Ronald Wetzel研究小组是以免疫球蛋白轻链可变区REI结构域为支架载体蛋白，构建了含有RGD序列的基因工程重组多肽。这些重组多肽有的没有表现出对血小板聚集抑制活性，有的表现出血小板聚集抑制活性，IC50在10-6M水平，这是迄今文献报道的基因工程重组RGD肽的最高活力。。德国科研人员Axel Knapp等选择水蛭素蛋白作为构建RGD多肽的载体蛋白，他们将重组多肽命名为Hirudisin，，Hiruisin的血小板聚集抑制活性的IC50值为6.5×10-5M，抗栓活力不高。本专利技术利用胰岛素原分子与天然蛇毒去整合素的可比性分子量小，具有多对二硫键，胰岛素原C肽构象类似RGD区，位于分子表面突环区，亲水性及柔性较好。同时基于目前对胰岛素结构性质的研究，C肽的置换被证明不影响胰岛素A、B链二硫键的正确形成，构象不会发生大的改变，将RGD序列置换胰岛素原的C肽，构建一种新型重组嵌合多肽，发挥RGD序列特有的功能，制造一种新型基因工程抗栓肽。为了确保该重组多肽的抗栓专一性，消除因载体蛋白而可能带来的副作用，我们选用A6，A1l双位点突变的胰岛素原作为构建RGD-人胰岛素的基因模板，消除RGD-人胰岛素的胰岛素降血糖活性，使构建的新型基因工程抗栓多肽是高效、专一的抗栓活性剂。专利技术的目的本项研究开发的目的是结合天然蛇毒抗栓肽与胰岛素多肽的结构与功能特点，利用现代基因工程手段构建新型抗血栓形成的多肽分子，以用于血液生物学、药理学和临床医疗学的基础研究和实际临床应用中。上述制备出的RGD-胰岛素功能多肽是一种高效专一的抗栓肽，它的化学结构和性质证明它符合我们原定设计目的。专利技术的内容与技术方案胰岛素原的C肽构象与天然蛇毒去整合素中RGD序列的构象相似，B链末端B30位点与A链A1位点之间空间距离约为7.5埃，因此设计嵌合RGD序列为CRGDSC(半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-半胱氨酸)，该序列取自纤维粘结蛋白，是一种血源性，与血小板整合素有较强亲和力的多肽，能表现较强抗栓活性功能的RGD序列。用于构建重组抗栓多肽的模板基因为-人胰岛素原基因，为本实验室自制。所应用的基因工程方法为自行设计，是PCR方法的多步组合。1.构建嵌合RGD序列于设计位点的RGD-人胰岛素基因，再用分子克隆技术连接至温控诱导表达质粒pBV220的EcoRI与BamHI位点，转化E.coli strain DH5a，获得基因工程菌克隆。2.基因工程菌的培养与诱导。3.RGD-INS的分离纯化。4.进行抗栓活性与胰岛素生物活性方面的分析。这是一种新型基因工程重组抗栓肽，构建此重组抗栓肽的基因工程方案为用于构建的基因工程方法共设计引物四条，应用PCR方法合成含有B链与CRGDSC六肽序列的编码框的DNA分子，第二轮PCR过程合成含有A链的编码框的DNA分子。第三轮PCR过程为构建RGD-INS重组多肽基因，将前二轮PCR过程合成的DNA分子连接，形成同时含有胰岛素B链、A链与CRGDSC六肽序列的编码框的DNA分子，CRGDSC序列位于B链B30与A链A1之间。实践证明，此基因工程方法优于目前国际上构建类似分子的PCR技术。。特点与应用上述基因工程RGD-INS抗栓多肽的化学结构不同于目前已知的所有天然蛇毒、水蛭抗栓肽以及其它具有抑制血栓形成功能的基因工程多肽。已证明其为一种新型抗栓多肽分子，不与已知其它功能相关多肽同源。其特点如下(1)RGD-INS有很强的抑制血小板聚集活性，IC50为0.35μM。(2)基于胰岛素分子骨架，无蛇毒抗栓肽的外源蛋白免疫原性。(3)基于A6，A11位点突变，无体内降血糖作用。(4)来源为基因工程菌，不受天然资源限制，可高密度发酵培养工程菌。(5)整个过程不使用有毒物质，不污染环境。由于该基因工程抗栓肽能有效结合血小板整合素GP IIb IIIa，竞争性抑制纤维蛋白原与血小板的粘附，固而可以作为一种血小板拮抗剂应用在对细胞表面受体整合素与去整合素相互作用的血液生物学，细胞生物学及受体分子生物学研究中，同时在药理学、临床医疗中具有较为广阔的应用前景，可作为一种医用抗栓剂治疗心脑血管性疾病。实施例1.基因工程菌的高密度发酵培养与RGD-INS抗栓多肽基因的温控诱导表达使用自动化监测酸碱pH、温度、溶液溶氧含量、营养补料等参数并能对其进行调节的发酵罐设备高密度发酵大量培养基因工本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以无活性胰岛素为骨架的含ＲＧＤ精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸肽的抗栓新药，其特征在于ＲＧＤ－ＩＮＳ的基因序列与多肽氨基酸序列如下：ＲＧＤ－ＩＮＳ的基因序列：５′ ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＡＴ ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＴＴ ＴＧＴ ＧＧＴ ＴＣＴ ＣＡＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＴＡＣＣＴＧ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＧＧ ＧＡＡ ＣＧＴ ＧＧＴ ＴＴＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＣＡ ＣＣＣ ＡＡＧ ＡＣＣ ＴＧＣ ＣＧＴＧＧＴ ＧＡＣ ＴＣＴ ＴＧＣ ＧＧＣ ＡＴＴ ＧＴ Ｇ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＣＣ ＴＧＣ ＡＣＣ ＡＧＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＣＣＣＴＣ ＴＡＣ ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＡＣ ＴＡＣ ＴＧＣ ＡＡＣ ３′ＲＧＤ－ＩＮＳ多肽的氨基酸序列：＊＊＊它是由５７个氨基酸残基组成的多肽，含 有三对二硫键。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐建国，井健，杨志宏，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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