一种基于液相色谱-高分辨质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于液相色谱‑高分辨质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，所述的定量分析方法包括以下步骤：1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末，然后依次加入甲醇、甲基叔丁基醚、水作为提取剂，超声，离心，取下层清液，加入内标溶液，离心浓缩去掉溶剂，加入乙腈复溶，复溶液转入液相色谱进样小瓶，待分析；2）标准曲线绘制；3）样品分析：将步骤（1）处理后的待分析样品进行液相色谱‑高分辨质谱分析，将得到的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰相对面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。本发明专利技术通过创造性的检测烟叶中马来酰肼自由态及马来酰肼糖苷结合态的含量，极大的提高了分析结果的准确性，方法简便、效率高。

A quantitative analysis method based on liquid chromatography high resolution mass spectrometry tobacco maleic hydrazide and its glucoside

Quantitative analysis method of the invention discloses a method based on liquid chromatography high resolution mass spectrometry tobacco maleic hydrazide and its glycosides, the quantitative analysis method includes the following steps: 1) sample preparation: weigh tobacco sample powder, followed by adding methanol and methyl tert butyl ether and water as the extraction solvent. Ultrasonic, centrifugal, take subnatant, adding internal standard solution, and centrifugation, remove the solvent, adding acetonitrile solution, complex solution into the liquid chromatography sample vial, 2) for analysis; standard curve; 3) sample analysis: step (1) after the treatment of the sample to be analyzed by liquid high-resolution mass spectrometry analysis chromatography, chromatographic peaks of maleic hydrazide obtained and its glucoside relative area of input calibration curve equation, the calculated concentration corresponding to the. The invention greatly improves the accuracy of the analysis result by creatively detecting the content of maleic hydrazide free state and maleic hydrazide glucoside binding state in tobacco leaves. The method is simple and efficient.

【技术实现步骤摘要】
一种基于液相色谱-高分辨质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法
本专利技术属于分析化学
，具体涉及一种基于液相色谱高分辨质谱技术的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法。
技术介绍
马来酰肼（1，2-二氢-3，6-哒嗪二酮，MaleicHydrazide，MH)是一种人工合成的植物生长调节剂。马来酰肼通过阻止细胞分裂而抑制烟草侧芽的生长，是国内外烟草行业常用的抑芽剂。马来酰肼作为常见农药在烟草种植上大量使用，其在烟叶中的残留也一直备受关注。国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）2013年颁布的烤后烟叶马来酰肼的指导残留水平（GRL）为80mg/kg。因此建立一种简单、快速分析烟叶中马来酰肼残留物的方法对于保障烟叶安全、杜绝马来酰肼抑芽剂的滥用具有重要意义。马来酰肼在烟叶中主要以自由态及糖苷结合态存在。其中糖苷结合态马来酰肼包括马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷和马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷。文献报道的烟叶中马来酰肼测定方法包括分光光度法、液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法、液相色谱质谱法等。这些方法包含只测自由态马来酰肼和将马来酰肼糖苷水解后测定其总量两种类型。其中只测自由态马来酰肼无法反映马来酰肼的真实残留量，而将马来酰肼糖苷水解后测定其总量的方法由于无法对两种糖苷物质是否彻底水解进行评价，其测定准确性也值得商榷。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于液相色谱高分辨质谱技术的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法。本专利技术的目的是这样实现的，包括以下步骤：1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末于离心管中，依次加入甲醇、甲基叔丁基醚、水作为提取剂，其中所述的甲醇-甲基叔丁基醚-水的体积比为30~40：40~50：65~75，然后超声，离心，取下层清液，加入内标溶液，离心浓缩去掉溶剂，加入乙腈复溶，复溶液转入液相色谱进样小瓶，待分析；2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10μg/mL的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取10、20、40、80、150、200μL标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10mg；当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100mg；制成不同浓度梯度的待测样本，离心浓缩，除去样品中的甲醇溶剂；然后按照步骤（1）中所述的样品前处理进行处理，再转至液相色谱-高分辨质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱相对内标的峰面积；将得到的相对峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；3）样品分析：将步骤（1）处理后的待分析样品进行液相色谱-高分辨质谱分析，将得到的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰相对面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：1、本专利技术建立了一种基于液相色谱-高分辨质谱的烟叶中马来酰肼及其糖苷的分析方法，通过创造性的检测烟叶中马来酰肼自由态及马来酰肼糖苷结合态的含量，极大的提高了分析结果的准确性，有效避免了现有技术中仅测自由态马来酰肼或者将马来酰肼糖苷水解后测定总量带来的不确定性，而且本专利技术的分析方法简便、效率高。2、该方法集中了液相色谱和高分辨质谱的高分离能力和高灵敏度的优点，整个分析过程简单、快速，为定量分析烟叶中马来酰肼及其代谢物提供了一种新的途径。3、本专利技术的样品前处理与现有的前处理方法相比，具有以下优点：第一，处理方法简单，只需要萃取、冻干、复溶等步骤即可。现在的行业标准方法（YC/T405.5-2011）要先进行浓盐酸水解，然后定容、固相萃取纯化、过滤等步骤，十分复杂。第二，更科学。YC/T405.5-2011无法对糖苷的水解情况进行评价，本方法直接测糖苷，避免了这个问题。第三，环境更友好。无需使用浓盐酸、氢氧化钠等水解所需的强酸强碱，不会对操作人员产生潜在的危害。第四，避免基质效应影响。本方法的标准曲线在基质中配制，有效的扣除了基质对定量分析的影响。而YC/T405.5-2011的标准曲线在空白溶剂中配制，无法扣除基质的影响。第五，本专利技术的采用甲醇、甲基叔丁基醚、水的混合溶液作为提取剂，通过合理的配比，萃取完成后溶液离心会自然分层，脂类、色素等弱极性物质在上层，马来酰肼及其糖苷等极性较强物质在下层，液液萃取的过程在离心时自然完成，因此无需额外的样品纯化步骤。4、本专利技术的液相色谱-高分辨质谱的分析方法相对现有行标的分析方法的优点：第一，特异性更好。本方法采用液相色谱高分辨质谱，相对行标YC/T405.5-2011的液相色谱接紫外检测器方法对马来酰肼及糖苷具有更好的分离能力，可有效的避免基质干扰。第二，灵敏度更高。本方法采用液相色谱高分辨质将基质与目标化合物进行了有效的分离，且质谱本身具有比紫外检测器更高的灵敏度，因此具有更高的分析灵敏度。第三，测定的指标更多。行标YC/T405.5-2011只能测定马来酰肼一个指标，本方法可以同时测定马来酰肼以及它的糖苷。5、由于马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷与马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷互为位置异构体，化学结构相似，在本专利技术的方法中具有一致的质谱离子，因此当实际工作中无法获得足够的马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的标准物质时，可以采用马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的校准曲线对马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷进行定量。附图说明图1为马来酰肼及其糖苷的化学结构图；图2为马来酰肼及其糖苷在烟叶样品中的提取离子色谱图，其中烟叶样品为100mg/株马来酰肼喷洒后第30天采样；图3为马来酰肼处理烟草一个月后马来酰肼及其糖苷残留情况。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的一种基于液相色谱-高分辨质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，包括以下步骤：1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末于离心管中，依次加入甲醇、甲基叔丁基醚、水作为提取剂，其中所述的甲醇-甲基叔丁基醚-水的体积比为30~40：40~50：65~75，超声，离心，取下层清液，加入内标溶液，离心浓缩去掉溶剂，加入乙腈复溶，复溶液转入液相色谱进样小瓶，待分析；2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10μg/mL的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取10、20、40、80、150、200μL标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10mg；当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100mg；制成不同浓度梯度的待测样本，离心浓缩，除去样品中的甲醇溶剂；然后按照步骤（1）中所述的样品前处理进行处理，再转至液相色谱-高分辨质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱相对内标的峰面积；将得到的相对峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；3）样品分析：将步骤（1）处理后的待分析样品进行液相色谱-高分辨质谱分析，将得到的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰相对面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末，每本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于液相色谱‑高分辨质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于包括以下步骤：1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末于离心管中，依次加入甲醇、甲基叔丁基醚、水作为提取剂，其中所述的甲醇‑甲基叔丁基醚‑水的体积比为30~40：40~50：65~75，然后超声，离心，取下层清液，加入内标溶液，离心浓缩去掉溶剂，加入乙腈复溶，复溶液转入液相色谱进样小瓶，待分析；2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10 μg/mL 的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取10、20、40、80、150、200 μL 标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10 mg；当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100 mg；制成不同浓度梯度的待测样本，离心浓缩，除去样品中的甲醇溶剂；然后按照步骤（1）中所述的样品前处理进行处理，再转至液相色谱‑高分辨质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱相对内标的峰面积；将得到的相对峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；3）样品分析：将步骤（1）处理后的待分析样品进行液相色谱‑高分辨质谱分析，将得到的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰相对面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。...

【技术特征摘要】
1.一种基于液相色谱-高分辨质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于包括以下步骤：1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末于离心管中，依次加入甲醇、甲基叔丁基醚、水作为提取剂，其中所述的甲醇-甲基叔丁基醚-水的体积比为30~40：40~50：65~75，然后超声，离心，取下层清液，加入内标溶液，离心浓缩去掉溶剂，加入乙腈复溶，复溶液转入液相色谱进样小瓶，待分析；2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10μg/mL的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取10、20、40、80、150、200μL标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10mg；当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100mg；制成不同浓度梯度的待测样本，离心浓缩，除去样品中的甲醇溶剂；然后按照步骤（1）中所述的样品前处理进行处理，再转至液相色谱-高分辨质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱相对内标的峰面积；将得到的相对峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；3）样品分析：将步骤（1）处理后的待分析样品进行液相色谱-高分辨质谱分析，将得到的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰相对面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。2.根据权利要求1所述的基于液相色谱-高分辨质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末，每100mg新鲜烟叶样品粉末共加入1500μL提取剂，所述的新鲜烟叶样品粉末的制备方法为：将新鲜的烟叶样品在液氮冷冻下研磨粉碎至小于40目，磨好样品迅速转入离心管封存于-80℃冰箱，备用。3.根据权利要求1所述的基于液相色谱-高分辨质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末，每10mg烤后烟叶样品粉末共加入1500μL提取剂，所述的烤后烟叶样品粉末的制备方法为：将烤后烟叶样品研磨粉碎至小于40目，磨好样品转入离心管封存于4℃冰箱，备用。4.根据权利要求1所述的基于液相色谱-高分辨质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李勇，逄涛，师君丽，孔光辉，吴玉萍，陈萍，赵立红，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53