秋水仙酮类化合物生物转化为相应3-O-糖基化衍生物的方法技术

利用巨大芽孢杆菌将秋水仙酮类化合物转化为相应的３—０－糖基衍生物。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用所选微生物菌株将类秋水仙素(colchicinoid)化合物生物转化为其3-O-糖基衍生物。本专利技术所述方法提供了由所述秋水仙酮(colchicone)类化合物为原料，高产率和高纯度地得到专门在芳香环A的C-3上糖基化的化合物。通过本专利技术的生物技术方法获得的化合物，尤其是硫代秋水仙酮松(thiocolchicosone)(3-O-葡糖基硫代秋水仙酮，即通式(I)中，R1＝-OCH3，R2＝-SCH3)是有重大药理学价值的活性成分，主要用于制备新的抗肿瘤药物。专利技术公开已有大量工作致力于通过化学反应或生物转化来获得通式(I)化合物以及相关的类秋水仙素化合物的高度特异性糖基化形式。化学途径包括连续的复杂、非特异性反应，这些涉及不同分子位点的非选择性反应导致生成糖基化衍生物的混合物，其中某些没有活性。因此，得到芳香环C-3特异地糖基化的有效产物的转化率非常低。生物方法主要涉及通过培养积雪草将类秋水仙素化合物(与秋水仙酮类化合物间接相关)，比如将秋水仙素和硫代秋水仙素生物转化为芳香环C-2和C-3单糖基化的衍生物；这一转化不是高度选择性的，并且产率、产量都低(Solet，J.M.等，植物化学33，4817-820，1993)。类秋水仙素化合物的其他生物转化工作只是将结合在芳香环(C-2和C-3)上的甲氧基去甲基化，但也总是有产率、产量有限以及区域选择性差的特点。因此，Hufford C.D.等(药物科学杂志，68，101239-1242，1979)用灰色链霉菌和/或壮观链霉菌，以及Bellet P.等(英国专利923421，1959)用不同链霉菌和其他细菌及真菌菌种的菌株，试图将秋水仙素及其衍生物转化为相应的3-去甲基化衍生物。这些已知方法的结果证实了以上所述与涉及到的微生物酶对例如生物碱分子的C-2、C-3或C-10的非选择性相关。并且，由于低转化率、可用底物浓度减少以及环庚三烯酚酮环经常发生降解，所述催化系统的产量水平极低。近来，Poulev等(发酵生物工程杂志79，133-38，1995)通过利用细菌类微生物已实现了特异性去甲基化，但产率、产量仍极低。其他化合物，比如美登木素生物碱(maytansinoids)(美国专利4361650Izawa，M.等，抗生素杂志34，121587-1590，1981)的生物转化，也利用了来自与前面提到的那些相类似的微生物(链霉菌、芽孢杆菌等)的酶活性。在这种情况下，催化反应也仅仅包括去甲基化，具有低转化率和产量的特点。巨大芽孢杆菌α-淀粉酶的糖基转移酶活性已有描述(Brumm.P.J.等，淀粉43，8319-323，1991)，该酶受体特异性(专门是葡萄糖或葡萄糖苷)极高。由相同微生物来源产生的环糊精-葡糖基转移酶催化由淀粉起始的rubusoside(13-O-β-D-葡糖基-甜菊糖醇-β-D-糖基酯)的α-1，4-转葡糖基化。同样在该生物转化中，转移酶反应的受体是底物糖类部分(Darise，M.等，Agric.Bioel.Chem.，48，102483-2488，1984)。环糊精-糖基转移酶先前被用于由淀粉来制备环糊精G6和G8(Kitahata，S.，Okada，S.，Agric.Bioel.Chem.38，122413-2417，1974)。这些例子证明巨大芽孢杆菌所表达的糖基转移酶活性的高度底物特异性，该酶仅涉及葡糖基受体，因此不可能期望在具有不同、复杂分子结构的次级代谢物(比如秋水仙酮类)上发生任何反应。实际上，目前还不知道将所述微生物用于将秋水仙酮类化合物酶转化为3-糖基衍生物的例子。现在发现能在有高浓度秋水仙酮(R1＝-OCH3，R2＝-OCH3)、3-去甲基秋水仙酮及它们各自的硫代衍生物的情况下生长的巨大芽孢杆菌菌株，有特别高、非常特异的将所述底物转化为专门在芳香环C-3发生糖基化的衍生物的生物转化活性。该转化发生在极短的时间内，并且有令人惊奇的高产率的特点。因此，本专利技术涉及制备通式(I)之3-O-糖基秋水仙酮类化合物的方法 其中R1是糖苷残基，R2是C1-C6烷氧基或C1-C6烷硫基，所述方法包含利用巨大芽孢杆菌来生物转化那些其中R1为OH或甲氧基的化合物。巨大芽孢杆菌是一种革兰氏阳性产芽孢细菌，其细胞直径在1.0μm以上；在多种培养基上好氧生长；过氧化氢酶阳性；水解明胶。通过检测生长和显微分析证明，可用于本专利技术的巨大芽孢杆菌菌株能够在有高浓度秋水仙酮、硫代秋水仙酮(R1＝-OCH3，R2＝-SCH3)及相应的3-去甲基衍生物(2g/l以上)的情况下令人满意地生长并维持活力。而同属的菌种(比如蜡状芽孢杆菌)被证明在底物浓度为1g/l时己生长困难(吸光度为对照的10-15％)。该生物转化的高选择性和高效率是令人惊奇且罕见的，产率水平在70％到95％。并且，用于该生物转化的微生物能够永久性地维持催化活性，即使在反复进行的发酵步骤中也是如此，因此为补料分批培养和连续培养提供了特异性生物转化。该方法从而可提供高产量和高再生水平。除了不寻常的产物得率，这种显著的反应区域选择性还能确保反应产物的高质量和高纯度，从而通过简单的下游操作可得到100％纯度的产物。另外，重要的优点在于产物纯化和回收步骤减少、操作经济以及使用的可确定性(affidability)和安全性。可用于本专利技术方法的操作顺序包含A)-从天然来源或保藏菌株中选择能在有高浓度秋水仙酮底物存在的情况下生长的巨大芽孢杆菌培养物。B)-通过对以渐增浓度施加的特异底物进行生物转化检测，从A)中挑选分离物来分析其转化生成相应3-O-糖基衍生物的转化催化活性。C)-对在B)中挑选到的菌株做微生物学鉴定。D)-通过从B)中目的特异性地选择菌群来逐渐增加生物转化率。E)-研究和优化关键的发酵参数，以优化生物转化。F)-研究和优化高产量培养物的保存方法以便保证稳定、均一的接种物在工业规模上的生产应用。G)-将该方法在发酵罐、分批培养、补料分批培养及连续培养中逐级放大。H)-逐步建立并优化用于下游操作和产物回收的方法。具体来说，可以从得自菌种保藏中心的保藏培养物，或者各种来源的土样，或者预选的工业菌株出发，通过在含有有机氮源(蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、天冬酰胺等)、碳源(甘油、淀粉、麦芽糖、葡萄糖等)的不同琼脂培养基(pH5到8，优选pH6-7)上选择性复壮来挑选可用于本专利技术的微生物，温育温度在20℃到45℃，优选28-40℃。利用标量稀释技术并平行地铺在用琼脂凝固的不同底物上来评价培养物在有毒性浓度之#底物的情况下的生长能力，部分底物中预先添加了浓度为0.1到3g/l的秋水仙酮类化合物(例如3-去甲基硫代秋水仙酮)以便抑制大部分微生物的生长。将能够在所述条件下生长的菌落无菌分离并置于不同的琼脂培养基上，以便检验其纯度和生长的均一性。用于保存培养物的培养基是典型的微生物基质，含有有机氮源(蛋白胨、酵母提取物、胰蛋白胨、肉提取物等)、碳源(葡萄糖、麦芽糖、甘油等)，pH5到8，优选6-7。培养温度在20℃到45℃，优选28-40℃。分析挑选出的微生物在有秋水仙酮类化合物存在的深层培养中的生长能力，以及将后者转化为相应的3-糖基衍生物的能力。该分析过程在100ml的烧瓶中进行，烧瓶中含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备通式（Ⅰ）之３－Ｏ－糖基秋水仙酮类化合物的方法： ＊＊＊ （Ⅰ） 其中Ｒ↓［１］是糖苷残基，Ｒ↓［２］是Ｃ↓［１］－Ｃ↓［６］烷氧基或Ｃ↓［１］－Ｃ↓［６］烷硫基，所述方法包含利用巨大芽孢杆菌来生物转化那些其中Ｒ↓［１］为ＯＨ或甲氧基的化合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：E邦巴戴利，C庞宗，
申请(专利权)人：因迪纳有限公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]