一种乙酰短杆菌及以该菌种为酶源制备5-氟尿苷的方法技术

本发明专利技术公开了一种乙酰短杆菌ＱＤ９６，以及以该菌种为酶源制备５－氟尿苷的方法。本发明专利技术利用该菌种产生的核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶，在微生物非增值情况下进行酶反应而生成５－ＦＵＲ。该方法可以采用较高的底物浓度，使摩尔转化率最高可达６０％，大大地降低了生产成本，能够满足医药工业的需要。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生化工程领域，涉及一种乙酰短杆菌及应用乙酰短杆菌制备5-氟尿苷的方法。5-氟尿苷的化学名为1-β-D-呋喃核糖基-5-氟尿嘧啶，其结构式如下所示 5-氟尿苷是一种重要的5-氟尿嘧啶衍生物，可以制备多种抗癌抗病毒药，如抗癌良药5’-脱氧-5-氟尿苷(英文名为5’-deoxy-5-fluorouridine，氟铁龙)及2’-脱氧-5-氟尿苷即以5-氟尿苷为起始原料。5-氟尿苷的制备方法从一般而言有化学合成法、发酵法和酶法。化学合成法有多种途径，较有代表性的有以下两种方法以5-氟尿嘧啶和核糖为原料5-氟尿嘧啶2、4位首先硅烷化，制备成三甲基硅烷基-5-氟尿嘧啶(A)；而核糖则首先制备成四乙酰核糖(B)。(A)和(B)用路易斯酸作催化剂进行反应，得到酰化的5-氟尿苷，再水解可获得5-氟尿苷；尿苷直接氟化尿苷首先制成三乙酰化尿苷，然后在溶剂中用氟气处理，形成中间产物，6-乙酰基-三乙酰-5、6-双氢尿苷，再在甲醇或甲醇钠中用Et3N先脱去6位的保护剂，再脱去核糖上的保护基，从而获得5-氟尿苷。上述方法需要用到昂贵的试剂及许多有机溶剂，对反应物的活性基团要进行保护和去保护，前者缩合反应选择性不高，有α-体产生，后者需要氟气，将造成环境污染。而近年来兴起的发酵法和酶法制备5-氟尿苷只需一步反应，不需要对某些基团保护或脱保护，缩合反应只产生β-体，并且还具有反应条件温和、不需要有毒有害的有机溶剂、环境污染小等优点，因此受到了人们的广泛重视。发酵法合成5-氟尿苷是利用枯草芽孢杆菌ATCC19062进行生产的，该方法在30℃下培养68小时后，添加5-氟尿嘧啶2mg/mL，52小时后，5-氟尿苷的含量仅为2.5mg/mL，因反应时间长，容易染菌而无实用价值。许多专利和文献公开了酶法制备5-氟尿苷的生产工艺。早期人们在研究5-FU抗癌机理时发现，癌细胞中尿苷磷酸化酶含量较高，可由5-氟尿嘧啶(简称5-FU)和核糖-1-磷酸可逆合成5-FUR，并用肿瘤细胞抽提物为酶源合成得到了5-FUR。日本专利JP 81102794采用Klebsiella pneumoniae ATCC9621为酶源，反应液配比为尿苷 1KH2PO40.855-FU 0.260℃反应5小时，得到5-FUR，含量为155mg/dL，转化率仅为38％(对5-FUR)；文献Biosci.Biotech.Biochem 1992；56(4)580-582在研究制备5-甲基尿苷时也合成获得了5-FUR。该方法虽然有较高的转化率(可达90％以上)，但由于存在需要添加多种酶制剂及反应浓度低等缺陷，因此，实用价值不高。本专利技术的目的在于克服上述缺陷，提供一种乙酰短杆菌属(Brevibacteriumacetyicum)的菌种和以该乙酰短杆菌为酶源制备5-FUR的生产方法，该方法可以采用较高的底物浓度，使摩尔转化率最高可达60％，大大地降低了生产成本，能够满足医药工业的需要。本专利技术的构思是这样的采用乙酰短杆菌完整细胞制备5-FUR，主要是利用其产生的核苷磷酸化酶，即嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶，在微生物非增值情况下进行酶反应而生成5-FUR。使用的微生物用于生产本专利技术所说的5-FUR的是一种属于乙酰短杆菌种的菌种，乙酰短杆菌(Brevibacterium acetyicum)QD96即为具有这种生产能力的菌种，以下简称QD96。该菌种与乙酰短杆菌ATCC954和乙酰短杆菌AT-6-7为同一种，对乙酰短杆菌ATCC954长期深冻，紫外线照射，γ射线辐射，化学试剂处理，(如硫酸二乙酯、亚硝酸、N-甲基-硝基-N-亚硝基胍等)，超声波等诱变处理，即可获得所说的乙酰短杆菌(Brevibacterium acetyicum)QD96。该菌种已于2000年7月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.0472。QD96菌种具有如下性质1．形态特征(1)细胞的形态和大小短杆状，0.8～1.0×1.0～1.2μm；(2)胞子的形成无；(3)革兰氏染色性阳性。2．在各种培养基上的生长状态(1)牛肉浸膏琼脂平板培养(30℃，48小时)菌落形状圆形(Circular)；菌落表面隆起扁平状(Flat)，平滑(Smooth)大小2～4mm；色调浅黄色。(2)牛肉浸膏琼脂斜面培养(28℃，48小时)生长良好；生长的形状疣状(Echinulate)。(3)牛肉浸膏明胶穿刺培养(20℃，6天)液化成层状(Straitiform)。(4)牛肉浸液体培养(28℃，48小时)生长表面形成菌环(Ring)，稍微生成沉渣(Sediment)。(5)石蕊牛乳培养基(28℃，4天)略凝固，可见陈化。3．生理生化特征(1)硝酸盐还原(28℃，5天)无还原性；(2)硫化氢生成(28℃，5天)无；(3)淀粉水解分解；(4)过氧化氢酶阳性；(5)吲哚生成无(6)由蛋白胨和精氨酸生成氨阴性；(7)甲基红试验阴性；(8)V-P试验阳性；(9)对氧的需求好气；(10)O-F试验(Hugh Leison法)F型(Fermentation)；(11)由糖生成酸阳性葡萄糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖；阴性阿拉伯糖、木糖、半乳糖、乳糖、山梨醇、肌糖和甘油；(12)生长pH范围6.0～9.0；(13)生长最适宜温度25～37℃；(14)抗5-FU能催化5-FU碱基转换反应；(15)嘌呤核苷磷酸化酶活性1.864单位(以鸟苷为底物)；(16)嘧啶核苷磷酸化酶活性14单位。根据文献“伯杰系统细菌学手册”，(Brrgey’s Manual of SystematicBacteriology)提供的鉴定方法和上述的试验结果表明，QD96菌种属于乙酰短杆菌类群，但又与原乙酰短杆菌有明显的不同，其主要不同之处在于原种5-FU转化率为零，QD96菌种能催化5-FU碱基转换反应；嘌呤核苷磷酸化酶活性1.864单位(以鸟苷为底物)；嘧啶核苷磷酸化酶活性14单位；色调为浅黄色。通过常规的发酵生产方法，可以培养上述的QD96菌种，以该菌种为酶源，由常规的酶催化反应可制得所说的5-氟尿苷。简述如下所说的乙酰短杆菌QD96是以碳源、氮源、无机盐以及必要的维生素等有机营养素加以培养的。所说的碳源可以采用葡萄糖、淀粉水解糖、淀粉、糖蜜、蔗糖、山梨醇等，所说的氮源可以采用尿素、氨水、酵母膏、牛肉膏、玉米浆、蛋白胨、大豆水解液等，所说的无机盐可以采用磷酸盐、锰盐和钾盐等，所说的维生素为VB、VB6等。其培养方法在许多文献上都有阐述，此处不再赘述。以上述方法所得的乙酰短杆菌QD96即可直接使用，或者进行进一步的菌体处理，如进行丙酮干燥、超声波处理、表面活性剂、冷冻干燥处理等，以达到提高传质效率、稳定酶活性和提高酶利用率的目的，一般不需提纯。将所得的乙酰短杆菌QD96置于含有碳源、氮源、无机盐等的无菌培养基中(pH=7.0)于28～37℃下培养24～48小时，将培养液离心分离后用磷酸盐溶液洗涤备用。将所说的乙酰短杆菌QD96菌体与核糖供体、5-氟尿嘧啶及必要的缓冲溶液置于反应器中，搅拌溶解，在pH=5.0～10，最佳为7～9，温度为30～70℃，最佳为60～65℃的条件下反应1～10小时，即可获得所说的5-氟本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙酰短杆菌ＱＤ９６（ＣＧＭＣＣ）Ｎｏ．０４７２。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邱蔚然，丁庆豹，闫蓬勃，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]